參附注射液對大鼠移植肝臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用

陳 波，賴 星

(1.重慶市第九人民醫(yī)院普外二科，重慶 400700;2.四川省宜賓市第三人民醫(yī)院普外一科，四川 宜賓 466000)

肝臟缺血-再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)是導(dǎo)致肝移植后供肝功能低下甚至原發(fā)性無功能的主要原因之一[1]。在原位肝移植過程中，供肝缺血、門靜脈阻斷和血流再灌注不可避免。參附注射液的基本藥理作用為增加冠狀動脈血流及血管灌注量、延長動物耐缺氧時(shí)間、保護(hù)缺血心肌等[2-3]。因此，本試驗(yàn)通過建立大鼠原位肝移植模型，觀察參附注射液對移植肝臟的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取健康雄性SD大鼠，體重240～280 g，10～12周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為SCXK渝20020003。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(Active motif公司);參附注射液(四川雅安三九藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51020664)。Beckman CX7型全自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原位肝移植模型的建立與分組

將SD大鼠分為參附組、對照組和模型組(n=20)。參附組供肝在獲取前經(jīng)腰靜脈灌注參附注射液(2 mL/100 g)、對照組注入等量生理鹽水，模型組不予處理。切取供肝置于0～4℃ UW保存液內(nèi)，參照兩袖套法建立同種異體肝移植模型[4];在門靜脈再灌注0，60，180 min后分別處死8只大鼠，抽取下腔靜脈血液5 mL，并切取肝左外葉組織備檢。

1.2.2 肝臟組織的病理學(xué)觀察

取左肝前葉肝組織，放入10%中性甲醛溶液中固定24～48 h，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片(片厚5μm)，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝功能檢測

抽腔靜脈血5 mL，血樣于4℃下以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，10 min，取上清液置于-70℃冰箱保存。使用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定再灌注0，60，180 min后血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對資料進(jìn)行獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以X±s表示，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般情況和病理改變

對照組和模型組大鼠術(shù)后180 min內(nèi)精神萎靡、皮毛粗糙、活動少、不進(jìn)水、小便黃染;參附組大鼠術(shù)后精神較好，可少量活動，可進(jìn)水。再灌注180 min后，對照組和模型組大量肝細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯凌亂，出現(xiàn)空泡樣變，血竇擴(kuò)張，匯管區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤;參附組僅少量肝細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)輕度凌亂，肝血竇輕度淤血，少量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷較對照組和模型組輕。

2.2 肝功能指標(biāo)

結(jié)果見表1。可見3組ALT和AST水平在再灌注0 min后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3組ALT和AST水平在再灌注60 min后都明顯升高，但參附組含量均明顯低于對照組和模型組(P＜0.05);再灌注180min后，3組ALT和AST水平仍然繼續(xù)升高，但參附組升高程度較低，且明顯低于對照組和模型組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠再灌注后肝功能和TNF-α水平變化比較(X ±s，n=20)

2.3 血清TNF－α

結(jié)果見表1。再灌注0 min后，3組TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);再灌注60，180 min后，3組TNF-α含量不斷升高，但參附組含量明顯低于對照組和模型組組(P＜0.05)。

3 討論

肝移植大鼠門靜脈被阻斷，促使TNF-α表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)黏附因子產(chǎn)生、補(bǔ)體激活、觸發(fā)中性粒細(xì)胞過氧化呼吸爆發(fā)等，是造成再灌注損傷的主要原因[5]。參附為中醫(yī)回陽救逆參附湯的中藥制劑，主要成分為人參皂苷和烏頭堿。研究證實(shí)，其基本藥理為增加冠狀動脈血流及血管灌注量、保護(hù)心肌、延長動物耐缺氧時(shí)間等。此外，人參皂苷能維持腦細(xì)胞能量代謝、改善腦內(nèi)血流、增加缺血側(cè)腦內(nèi)三磷酸腺苷含量，并能阻止細(xì)胞鈣通道，防止鈣超載，減輕腦內(nèi)鈣離子積聚，抑制或減輕細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[6-7]。

本試驗(yàn)通過參附預(yù)處理供肝，建立大鼠肝移植缺血-再灌注模型，觀察其對移植肝臟的保護(hù)作用。結(jié)果表明，術(shù)后0 min，參附并未發(fā)揮有效作用;術(shù)后60 min和180 min，參附組ALT和AST含量明顯低于對照組和模型組，且肝組織病理學(xué)改變較輕。ELISA檢測血清TNF-α結(jié)果表明，術(shù)后60 min和180 min，雖然TNF-α的表達(dá)量不斷升高，但參附組明顯低于對照組和模型組，表明參附的作用機(jī)制在于降低了TNF-α的表達(dá)。

TNF-α可通過誘導(dǎo)黏附因子產(chǎn)生、補(bǔ)體激活、觸發(fā)中性粒細(xì)胞過氧化呼吸瀑布式反應(yīng)等，是造成缺血-再灌注損害的關(guān)鍵細(xì)胞因子[8]。本試驗(yàn)證明，參附對缺血-再灌注肝臟有明顯保護(hù)作用，為臨床預(yù)防肝移植術(shù)后的肝功能不全、肝切除術(shù)后肝功能損害提供了一個(gè)新的研究方向。

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