芥子氣誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的時(shí)效和量效研究

楊積順，徐立平，胡晉紅

(1.中國人民解放軍第100醫(yī)院藥械科，江蘇 蘇州 215007;2.第二軍醫(yī)大學(xué)上海長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

銀屑病是一種T細(xì)胞引發(fā)并維持的自身免疫性疾病[1]，患者機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，健康細(xì)胞受到攻擊，導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)各種形態(tài)的皮膚紅斑鱗屑性炎癥病變。銀屑病患者全層皮膚均存在異常，真皮成纖維細(xì)胞在銀屑病發(fā)展中扮演了重要的調(diào)節(jié)作用[2]。芥子氣(sulfur mustard，SM)的化學(xué)名為“二氯二乙硫醚”，對(duì)皮膚有較強(qiáng)的滲透性。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的胞外區(qū)與腫瘤壞死因子(TNF)和Fas蛋白的配體(FasL)有較高的同源性，屬于腫瘤壞死因子超家族的新型凋亡分子，通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮生理作用。TRAIL的主要功能是參與變異細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒有損傷。臨床經(jīng)驗(yàn)證明，芥子氣軟膏對(duì)銀屑病癥狀和機(jī)體炎性狀態(tài)的改善發(fā)揮了重要作用，但其治療機(jī)制尚不明確。本研究中探討了芥子氣對(duì)真皮成纖維細(xì)胞分泌TRAIL的影響，旨在為研究芥子氣治療銀屑病的機(jī)制提供參考。

1 儀器、試藥與方法

1.1 儀器、試藥

單道數(shù)字可調(diào)微量移液器(日本Nichiryo公司);ELX-800型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek instruments Inc)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠);細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿(Corning-Costar CO.，Becton Dickinson Labware)。膠原酶(CLS-1，Worthington Biochemical Corp.);分散酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，胰蛋白酶(tissue culture grade)均為 AMRESCO公司產(chǎn)品;小牛血清(GIBCO);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(high glucose，GIBCO/BRL);二甲基亞砜(DMSO，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);青霉素(80萬U)，鏈霉素(1g)，均為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。Human TRAIL ELISA Kit(Bender Medsystems GmbH)。芥子氣 (SM，第二軍醫(yī)大學(xué)防化教研室)，密度1.27 g/mL，純度96%，液態(tài);加入10 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基溶解，得濃度為500μmol/L的貯備液，使用時(shí)以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至規(guī)定濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取采用包皮環(huán)切術(shù)切下的健康人包皮，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血跡，置0.05%醋酸洗必泰滅菌溶液中清洗、消毒5 min，以磷酸鹽緩沖液沖洗后，盡量去除皮下組織，用手術(shù)剪刀將皮膚切成0.5 cm2大小的皮塊，置0.2%的分散酶溶液中，4℃消化過夜。次日取出皮塊，輕輕將消化液蕩干，用鑷子將表皮與真皮層分開;將分離出的真皮層剪碎，放入0.2%膠原酶溶液中，37℃消化4～5 h，去除上層膠原酶，加入15 mL含20%新生牛血清(NBS)的DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，過80目消毒不銹鋼紗網(wǎng)，再過200目消毒尼龍篩網(wǎng)后，1 000 r/min離心10 min，棄除上清液，用20%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，制成細(xì)胞懸液，以臺(tái)盼藍(lán)染色，測定真皮細(xì)胞活力。細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃及5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d后換液1次，待細(xì)胞生長近融合(70% ～80%)后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代，取第5～10代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 時(shí)效關(guān)系試驗(yàn)

取生長良好的真皮成纖維細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。分別用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃及5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞平穩(wěn)生長至70%～80%融合后，換以無血清DMEM培養(yǎng)基，靜息 24 h。用含芥子氣終濃度分別為 62.50，15.63，7.81，3.91，1.95μmol/L的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間(24，48，72 h)，以DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每組平行設(shè)3復(fù)孔。吸取上清液，1 000 r/min離心5 min，-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測TRAIL的含量。

1.2.3 量效關(guān)系試驗(yàn)

取生長良好的真皮成纖維細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。分別用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃及5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞平穩(wěn)生長至70%～80%融合后，換以無血清DMEM培養(yǎng)基，靜息24 h。以DMEM培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每孔加入不同濃度的含芥子氣的無血清培養(yǎng)基，使芥子氣終濃度分別為62.50，15.63，7.81，3.91，1.95 μmol/L。每組平行設(shè) 3 復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清液，1 000 r/min離心5 min，-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測TRAIL的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以X±s表示，用SPSS10.0軟件分析。

2 結(jié)果

在整個(gè)試驗(yàn)中，采用的是經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代10～20代的真皮成纖維細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察，真皮成纖維細(xì)胞呈梭形或長纖維狀，胞體狹長，邊界清楚，胞漿豐富，細(xì)胞核呈卵圓形，靠近胞質(zhì)中央;細(xì)胞排列規(guī)則，呈漩渦狀或放射狀，隨細(xì)胞增殖而布滿培養(yǎng)皿底部，培養(yǎng)2～3 d即可融合。

用不同濃度的芥子氣刺激真皮成纖維細(xì)胞24，48，72 h后，酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果顯示，真皮成纖維細(xì)胞本身可分泌少量的TRAIL，芥子氣刺激可使TRAIL的分泌量增多，并具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。結(jié)果見表1。

表1 不同時(shí)間和濃度的芥子氣刺激真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)TRAIL的量(X ±s，n=3)

3 討論

銀屑病的組織病理既有表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生，還存在真皮乳頭增生、毛細(xì)血管擴(kuò)張，還有學(xué)者認(rèn)為銀屑病皮損也存在成纖維細(xì)胞的過度增生。本研究中所選擇的芥子氣濃度均對(duì)真皮成纖維細(xì)胞沒有毒性，且低于臨床上使用的濃度。近期研究表明，TRAIL能夠阻止自身免疫性疾病的進(jìn)展，可能對(duì)某些慢性自身免疫性疾病的治療有益[3]。TRAIL能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞沒有明顯的毒性，是一種極具潛力的抗腫瘤壞死因子，因而受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視和深入研究[4]。銀屑病亦是以細(xì)胞過度增生伴炎性細(xì)胞浸潤等病理改變的疾病，臨床研究證實(shí)，現(xiàn)行許多抗癌藥物對(duì)頑固性銀屑病的治療發(fā)揮了重要作用，取得了明顯的臨床療效，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為銀屑病藥物治療的新目標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，真皮成纖維細(xì)胞自身可以分泌TRAIL，芥子氣刺激后可以顯著上調(diào)TRAIL的表達(dá)，且分泌趨勢具有明顯的量效和時(shí)效依賴性。因此推測，芥子氣治療銀屑病的作用機(jī)制可能與其促進(jìn)TRAIL的分泌，從而發(fā)揮抗銀屑病效果有關(guān)。

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