Infliximab對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸道屏障損害的保護(hù)作用

歐婭 賈林 邱嘉華 李偉冬 黃耀星 聶玉強(qiáng)

·論著·

Infliximab對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腸道屏障損害的保護(hù)作用

歐婭 賈林 邱嘉華 李偉冬 黃耀星 聶玉強(qiáng)

目的探討infliximab(TNF-α單抗)對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)并多器官功能障礙綜合征(MODS)模型腸動(dòng)力及腸屏障損害的保護(hù)作用。方法30只SD大鼠按完全隨機(jī)法分為假手術(shù)組、ANP組和infliximab組。經(jīng)胰膽管逆行注射4.5%牛磺膽酸鈉制備大鼠ANP并MODS模型，infliximab組于建模后6 h經(jīng)尾靜脈給予infliximab 8 mg/kg體重，對(duì)照組胰膽管逆行注射等量生理鹽水。24 h后處死大鼠，檢測(cè)血淀粉酶、TNF-α水平及二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量；胰腺及小腸組織常規(guī)病理檢查及評(píng)分；碳素墨水法測(cè)小腸推進(jìn)率。結(jié)果對(duì)照組、ANP組、infliximab組血清淀粉酶水平分別為(1125±331)、(11024±2203)、(545±30)U/L；TNF-α水平為(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L；胰腺病理評(píng)分為(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分；小腸病理評(píng)分為(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分；血清DAO含量為(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58) μg/L；D-乳酸含量為(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25) mmol/L；小腸推進(jìn)率為(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論早期使用infliximab可有效改善ANP大鼠的胃腸動(dòng)力功能及減輕腸屏障損害。

胰腺炎，急性壞死性； 腫瘤壞死因子； 單克隆抗體； Infliximab； 腸道屏障

重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病機(jī)制中，TNF-α是一系列瀑布樣級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)的始動(dòng)和促進(jìn)因子，可導(dǎo)致腸屏障功能障礙，促使細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎(ANP)建模后6 h為抗炎癥介質(zhì)治療窗。為此，本實(shí)驗(yàn)用TNF-α單抗infliximab干預(yù)ANP大鼠，觀察其對(duì)ANP并MODS大鼠腸道屏障損害的保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雌性SD大鼠30只，體重190～220 g，SPF級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按完全隨機(jī)法分成假手術(shù)組、ANP組和infliximab組。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，不禁水。采用4.5%?；悄懰徕c(Sigma公司)胰管內(nèi)逆行注射的方法制備大鼠ANP并MODS模型[3]。假手術(shù)組向胰管內(nèi)逆行注射等量生理鹽水。infliximab組大鼠于建模后6 h經(jīng)尾靜脈注射8 mg/kg體重的infliximab(西安楊森公司)。建模后23.5 h經(jīng)灌胃針給予碳素墨水灌胃，每只2.5 ml，30 min后處死大鼠并解剖，留取胰腺、小腸標(biāo)本；腹腔靜脈采血，離心取血清，置-80℃冰箱保存。

二、檢測(cè)指標(biāo)及方法

1．血清淀粉酶、TNF-α、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)耦合法測(cè)定血淀粉酶。ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、DAO水平，試劑盒分別購(gòu)自美津生物公司及R&D公司。采用改良分光光度法測(cè)定血清D-乳酸水平，試劑盒購(gòu)自博世生物公司。

2．小腸推進(jìn)率測(cè)定：將留取的腸管展于白紙上，以幽門為基點(diǎn)，無(wú)張力狀態(tài)下量取幽門括約肌至色素最前端及至盲腸的距離，以兩者百分比為小腸推進(jìn)率，評(píng)價(jià)腸道動(dòng)力。

3．組織學(xué)檢查：留取的大鼠胰腺及小腸組織常規(guī)行病理學(xué)檢查，由專一病理醫(yī)師閱片，并按照schemidt標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胰腺組織病理評(píng)分[4]，按照Chiu′s分級(jí)進(jìn)行小腸組織病理評(píng)分[5]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般情況

假手術(shù)組大鼠一般情況良好，無(wú)死亡。ANP組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹脹、豎毛、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、無(wú)大便排出等表現(xiàn)，造模24 h內(nèi)死亡3只。infliximab組大鼠一般情況較好，多數(shù)排稀便，造模24 h內(nèi)死亡2只。

二、血清淀粉酶、TNF-α水平與胰腺病理改變

造模24 h后，假手術(shù)組、ANP組與infliximab組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1125±331)、(11024±2204)、(545±30)U/L，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.76、21.49、24.36，P<0.05)；TNF-α水平分別為(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L，各組比較差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.2、4.55、13.45，P<0.05)。假手術(shù)組胰腺輕度間質(zhì)水腫，腺泡局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)；ANP組胰腺?gòu)V泛間質(zhì)水腫，成堆腺泡壞死，大量出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；infliximab組胰腺損傷較ANP組有不同程度的減輕。假手術(shù)組、ANP組與infliximab組胰腺病理評(píng)分分別為(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.589、5.215、8.223，P<0.05)。

三、血清DAO、D-乳酸水平的變化

假手術(shù)組、ANP組、infliximab組血清DAO水平分別為(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58)μg/L，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.457、3.649、0.865，P<0.05)；D-乳酸水平為(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25)mmol/L，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.345、4.079、4.797，P<0.05)。

四、小腸病理改變及小腸推進(jìn)率

造模24 h后，假手術(shù)組僅見腸道黏膜輕度水腫；ANP組腸道黏膜結(jié)構(gòu)破壞，絨毛上皮水腫，可見局部上皮脫落及潰瘍形成，黏膜間質(zhì)固有層毛細(xì)血管及淋巴管擴(kuò)張，血管內(nèi)可見積聚的紅細(xì)胞，并見少量圓形細(xì)胞浸潤(rùn)；infliximab組腸黏膜改變程度較ANP組顯著減輕(圖1)。假手術(shù)組、ANP組、infliximab組大鼠小腸組織病理評(píng)分分別為(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.305、0.026、0.147，P<0.05)；小腸推進(jìn)率分別為(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各組間比較差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.586、3.889、0.316，P<0.05)。

圖1假手術(shù)組(a)、ANP 組(b)、infliximab組(c)大鼠小腸病理改變 (HE ×10)

討 論

ANP是一個(gè)全身炎癥反應(yīng)過程，早期的內(nèi)毒素血癥刺激TNF-α釋放。TNF-α作為一種炎癥啟動(dòng)因子，促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生[6]，致使腸黏膜細(xì)胞因缺血、缺氧、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等因素而發(fā)生損傷，腸道屏障通透性升高，腸道內(nèi)細(xì)菌及毒素通過受損的腸黏膜屏障發(fā)生易位，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，引起壞死的胰腺組織繼發(fā)感染和多器官功能不全[7]。DAO存在于哺乳動(dòng)物的黏膜上層和絨毛上層細(xì)胞內(nèi)，主要位于小腸黏膜，血中含量極低；而D-乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物不具備將其分解代謝的酶系統(tǒng)。當(dāng)腸黏膜通透性增加時(shí),DAO及腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過受損黏膜入血,故監(jiān)測(cè)血中DAO和D-乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損害程度和通透性變化，成為腸黏膜損害的重要指標(biāo)[8-9]。

Infliximab為TNF-α的單克隆抗體，可抑制TNF-α的生理活性，阻止其誘導(dǎo)的瀑布樣級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)[10]。我們前期的研究顯示，建模后6 h使用infliximab可有效抑制TNF-α介導(dǎo)的SIRS、減輕胰腺炎癥和降低MODS發(fā)生率[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，infliximab可顯著減輕小腸病理?yè)p傷，增加ANP大鼠的小腸推進(jìn)率、降低ANP大鼠血清DAO及D-乳酸水平，提示在抗炎癥介質(zhì)治療窗口期應(yīng)用infliximab有利于減輕TNF-α介導(dǎo)的腸道炎性反應(yīng)，改善腸動(dòng)力，減輕腸屏障損害，對(duì)ANP時(shí)的腸道屏障功能起保護(hù)作用。

[1] 賈林，邱嘉華，黃耀星，等.抗炎癥介質(zhì)治療窗使用Infliximab對(duì)大鼠ANP并MODS模型的實(shí)驗(yàn)療效.廣州醫(yī)藥，2011，42：3-4.

[2] Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. TNF-alpha as a therapeutic target in acute pancreatitis——lessons from experimental models. Scientific World Journal. 2007, 30:431-448.

[3] 邱嘉華，陳奕金，賈林，等.?；悄懰徕c誘導(dǎo)急性壞死性胰腺炎大鼠模型的理想濃度.中華胰腺病雜志, 2010，10：120-122.

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[8] 吳彪，王春友.急性胰腺炎腸道屏障功能損傷時(shí)血漿內(nèi)毒素和D-乳酸的變化.中國(guó)普通外科雜志，2009，3:224-227.

[9] 黎君友,呂藝,付小兵,等. 二胺氧化酶在創(chuàng)傷后腸道損傷中變化及意義.中國(guó)危重病醫(yī)學(xué)雜志,2000,12:482-484.

[10] Xu P, Xu K, Wang J, et al. Pioglitazone: a promising therapeutic tool in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis. Dig Dis Sci,2011,56 :1082-1089.

[11] 賈林，陳奕金，黃耀星，等.重癥急性胰腺炎大鼠模型腹腔內(nèi)壓和血TNF-α的時(shí)相改變及規(guī)律. 中華胰腺病雜志，2010，10 ：106-108.

Infliximabonintestinalbarrierinjureinratswithacutenecrotizingpancreatits

OUYa,JIALin,QIUJua-hua,LIWei-dong,HUANGYao-xing,NIEYu-qiang.
DepartmentofGastroenterology,FirstMunicipalPeople′sHospitalofGuangzhou,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China

JIALin,Email:jialin@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the effects of infliximab (TNF-α monoclonal antibody) on intestinal barrier injury in ANP complicated with MODS in a rat model.MethodsThirty SD rats were randomly divided into sham operation group (SO), ANP group and infliximab treatment group. Sodium taurocholate (4.5%) was injected into the pancreatic duct to induce ANP complicated with MODS model. Infliximab (8 mg/kg) was injected via tail vein in 6h after modeling in infliximab group. Same amount of 0.9% NS was injected into the pancreatic duct in SO group. After 24 h of modeling, all rats were sacrificed, intestine and pancreas samples were collected for pathologic examination. The blood samples were harvested. The serum levels of amylase, TNF-α, diamine oxidase(DAO), D-lactate, and the rate of carbon propelling in ileum were measured.ResultsThe serum levels of amylase were (1125±331), (11024±2203), (545±30)U/L in SO group, ANP group and infliximab group; the serum levels of TNF-α were (12.1±4.0), (107.6±18.5), (75.8±5.9)U/L; the pathological scores of pancreas were 2.25±0.38, 14.10±0.22, 3.93±0.67, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05). The pathological scores of intestine were 2.29±0.32, 6.61±0.58, 3.91±0.41; the DAO levels were (87.88±34.51),(146.30±12.99), (115.00±18.58)ng/ml; the D-lactate levels were (1.50±0.49), (2.32±0.35), (2.02±0.25)mmol/L; and the rates of carbon propelling in ileum were (0.64±0.04)%, (0.28±0.08)%, (0.52±0.09)%, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsInfliximab can effectively prevent dysfunction of intestinal barrier and improve motility in ANP rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Monoclonod antibodies; Infliximab; Intestinal barrier function

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.015

廣東省中醫(yī)藥局科研課題(008006)、廣州市中西醫(yī)結(jié)合科研課題(2008A02)

510180 廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

賈林，Email:jialin@medmail.com.cn

2011-04-25)

(本文編輯：屠振興)