外源性PTEN對胰腺癌細(xì)胞ASPC-1增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響

李宏宇 李建軍 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志 郭曉鐘

·論著·

外源性PTEN對胰腺癌細(xì)胞ASPC-1增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響

李宏宇 李建軍 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志 郭曉鐘

目的研究第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)對胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達(dá)、裸鼠成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。方法將含PTEN基因的質(zhì)粒pE-PTEN轉(zhuǎn)染ASPC-1細(xì)胞，以空質(zhì)粒pE轉(zhuǎn)染為對照，分別獲得ASPC-1-pE-PTEN(A-pE-P)細(xì)胞及ASPC-1-pE(A-pE)細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR檢測細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測PTEN、VEGF、EGFR蛋白表達(dá)；克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察克隆形成數(shù)；Transwell小室觀察細(xì)胞侵襲能力；裸鼠皮下注射癌細(xì)胞法觀察成瘤情況。結(jié)果與ASPC-1細(xì)胞比較，A-pE-P細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)增加179.3%，PTEN蛋白表達(dá)明顯增加;VEGF蛋白表達(dá)明顯減少；EGFR蛋白表達(dá)無明顯變化；G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯增加[(31.5±1.76)%比(26.81±1.03)%，P<0.05]；克隆形成數(shù)降低[(24.0±3.9)比(33.3±3.4)，F(xiàn)=4.283，P<0.01]，克隆形成率降低28%；穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少[每高倍視野(46.3±6.6)比(63.8±7.5)個(gè)，F(xiàn)=2.476，P<0.05];種植瘤體積明顯縮小[(142.4±30.9)比(202.7±43.6)mm3，t=4.834，P<0.01]，抑瘤率達(dá)42.4%；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶明顯減少[(2.0±0.7)比(5.0±1.3)個(gè)，t=0.451，P<0.01]。結(jié)論P(yáng)TEN基因轉(zhuǎn)染后ASPC-1細(xì)胞VEGF表達(dá)減少，細(xì)胞生長被阻滯在G2/M期，增殖及轉(zhuǎn)移被抑制。

胰腺腫瘤； 基因，腫瘤抑制； 轉(zhuǎn)染； 第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因

第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensinhomology deleted on chromo-some ten, PTEN)位于人10號染色體q23.3區(qū)。目前研究認(rèn)為，PTEN可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但尚不多見。本研究觀察PTEN基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1后對細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達(dá)，細(xì)胞周期、克隆形成，裸鼠種植瘤形成及轉(zhuǎn)移的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1、pEAK8-PTEN及pEAK8質(zhì)粒由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科提供。使用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(保靈曼公司)將pEAK8-PTEN和pEAK8分別轉(zhuǎn)染ASPC-1細(xì)胞。應(yīng)用嘌呤霉素(1 mg/L，Gibco公司)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞30 d，挑選陽性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為ASPC-1-pEAK8-PTEN(A-pE-P)和ASPC-1-pEAK8(A-pE)細(xì)胞。

二、方法

1．RT-PCR：應(yīng)用TriPure試劑(Roche公司)提取各組細(xì)胞總RNA。應(yīng)用RT-PCR方法檢測細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)，試劑盒購自日本Takara公司。序列：PTEN正義5′-CATTATGACACCGCCAAA-3′,反義5′-TTGCCCCGATGTAATAAA-3′，產(chǎn)物209 bp；β-actin正義5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′,反義5′-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3′，產(chǎn)物381 bp，引物由上海生工公司合成。PCR條件：94℃ 4 min， 94℃ 30 s、56℃ 40 s、72℃ 40 s，30次循環(huán)，72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、掃描，以PTEN與β-actin條帶灰度比值表示mRNA相對表達(dá)量。

2．免疫細(xì)胞化學(xué)法：細(xì)胞行爬片培養(yǎng)，應(yīng)用PV9000二步法免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)檢測細(xì)胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白的表達(dá)。鼠抗人VEGF、PTEN抗體購自Santa Cruz公司，鼠抗人EGFR單抗購自福州邁新生物公司。

3．細(xì)胞周期檢測：取各組細(xì)胞，PBS洗滌后，-20℃乙醇4℃固定，加入核糖核酸酶及碘化丙啶染色，上FACScan流式細(xì)胞儀，用488 nm激發(fā)光測細(xì)胞周期。設(shè)3個(gè)平行樣，重復(fù)一次，取均值。

4．細(xì)胞克隆形成率：取各組細(xì)胞，逐級稀釋后接種于培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)14 d，乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆≥50個(gè)細(xì)胞，計(jì)算克隆形成率(PE)。PE=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。

5．Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)：將各組細(xì)胞分別加入Transwell小室上層，下層加600 μl含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及作為趨化因子的HGF，常規(guī)培養(yǎng)16 h，取出濾膜，擦去上層面細(xì)胞，中性甲醛固定，蘇木素染色，高倍鏡下觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，并重復(fù)一次，取均值。

6．裸鼠種植瘤形成及轉(zhuǎn)移：取20只4～6周齡 Balb/C裸鼠，按完全隨機(jī)法分為A-pE-P組和ASPC-1組，各10只。每只裸鼠腹股溝皮下注射1×107個(gè)腫瘤細(xì)胞。1、5周后處死小鼠，測量腫瘤體積，記錄轉(zhuǎn)移灶。腫瘤體積=1/6×π×長徑×短徑2。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)

ASPC-1、A-pE和A-pE-P細(xì)胞PTEN mRNA相對表達(dá)量分別20.33±9.42、14.97±8.17、56.77±16.85(圖1)， A-pE-P細(xì)胞的表達(dá)較ASPC-1細(xì)胞增強(qiáng)179.3%(F=20.35,P<0.01)。

圖1 ASPC-1、A-pE、A-pE-P細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)

二、細(xì)胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白表達(dá)

ASPC-1、A-pE細(xì)胞低表達(dá)PTEN，高表達(dá)VEGF；A-pE-P細(xì)胞高表達(dá)PTEN，低表達(dá)VEGF；3組細(xì)胞EGFR表達(dá)無明顯差異(圖2)。

圖2A-pE(上)、A-pE-P(下)細(xì)胞的PTEN(a)、VEGF(b)、 EGFR(c)蛋白表達(dá)(免疫組化 ×200或400)

三、細(xì)胞周期、克隆形成率

A-pE-P細(xì)胞G2/M、S期細(xì)胞較ASPC-1、A-pE細(xì)胞顯著增多；G1期細(xì)胞減少(表1)。ASPC-1、A-pE、A-pE-P細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為(33.3±3.4)、(31.7±4.3)、(24.0±3.9)個(gè)，A-pE-P組較ASPC-3組降低了28.0%(F=4.283,P<0.05)。

表1 各組ASPC-1細(xì)胞周期的分布

四、細(xì)胞體外侵襲能力

ASPC-1、A-pE、A-pE-P組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(63.8±7.5)、(61.5±6.3)、(46.3±6.6)個(gè)，A-pE-P組較ASPC-3組顯著減少(F=2.476，P<0.05)。

五、種植瘤生長及轉(zhuǎn)移

細(xì)胞接種1周后，A-pE-p、ASPC-1組裸鼠均出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，成瘤率100%，瘤體積為(1.3±0.1)mm3和(1.4±0.2)mm3，無顯著差異，均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；5周時(shí)，A-pE-p組瘤體積為(142.4±30.9)mm3，顯著小于ASPC1組的(202.7±43.6)mm3(t=4.834，P<0.01)，抑瘤率達(dá)42.4%。A-pE-P組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶(2.0±0.7)個(gè)，顯著低于ASPC-1組的(5.0±1.3)個(gè)(t=0.451，P<0.01)。轉(zhuǎn)移以肺臟、腋下和腹股溝淋巴結(jié)為主，僅1只出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移。

討 論

PTEN參與細(xì)胞分裂、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)及ECM代謝等多種生物學(xué)過程[1]。PTEN編碼雙重底物特異性磷酸酶，具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性，其蛋白磷酸酶活性在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起主要作用[2-3]，PTEN可通過抑制PIP3激酶活性，阻斷Akt的作用[4]，使細(xì)胞阻滯在G2/M期，同時(shí)啟動凋亡程序，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PTEN的ASPC-1細(xì)胞明顯被阻滯在G2/M期，并有部分細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，與Saito等[6]的研究結(jié)果一致。但有研究結(jié)果顯示，PTEN使細(xì)胞阻滯在G1期。這種分歧可能因PTEN對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有細(xì)胞型和劑量依賴性的差別。此外，轉(zhuǎn)染PTEN的ASPC-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)明顯減弱，而EGFR蛋白表達(dá)水平無明顯改變，表明PTEN可抑制VEGF的表達(dá)，而與EGFR表達(dá)無關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，種植A-pE-P細(xì)胞的裸鼠，瘤塊生長緩慢，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少，表明PTEN蛋白的過表達(dá)可能通過減少細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的能力。

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HeterogeneousPTENinhibitsASPC-1cellproliferation,invasionandmetastasis

LIHong-yu,LIJian-jun,LIUXu,WUChun-yan,ZHAOJia-jun,CHENYan-zhi,GUOXiao-zhong.
DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840，China

GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of heterogeneous phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome ten (PTEN) on cell cycles, proliferation, invasion, tumorigenicity, metastasis and the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) proteins in human pancreas cancer cell line (ASPC-1).MethodsASPC-1 cells was transfected with plasmid pE-PTEN containing PTEN, and empty plasmid pE-PTEN transfection was used as control, then ASPC-1-pE-PTEN (A-pE-P) cell and ASPC-1-pE (A-pE) cell was obtained. The expression of PTEN mRNA was determined by RT-PCR. PTEN, VEGF and EGFR proteins were measured by cell immunohistochemical method. Clone formation assay was used to observe the numbers of clone. Transwell was used to test the invasion ability of cells. The growths of tumor were detected by nude mice subcutaneous injection of cancer cells in vivo.ResultsCompared with ASPC-1, the expressions of PTEN mRNA of A-pE-P increased by 179.3%, and the expressions of PTEN protein were also significantly increased. The expressions of VEGF protein were significantly decreased. The expressions of EGFR protein were not significantly changed. Number of G2/M phase cells was significantly increased from (26.81±1.03)% to (31.5±1.76)% (P<0.05). The numbers of clone was decreased by 28%(P<0.05). The number of penetrating cells was decreased [(46.3±6.6)vs(63.8±7.5) per high power field,P<0.05]. The tumor volumes were significantly reduced [(142.4±30.9)vs(202.7±43.6) mm3,P<0.05]. The tumor inhibitory rate was 42.4%. The distant metastases were significantly reduced [(2.0±0.7)vs(5.0±1.3),P<0.01].ConclusionsHeterogeneous PTEN can not only inhibit the proliferation, invasion and metastasis of ASPC-1 cells, arrest the cell growth at G2/M phase, but also decrease the expressions of VEGF.

Pancreatic neoplasms; Gene, tumor suppressor; Transfection; Phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.005

遼寧省博士啟動基金(20081044)；遼寧省教育廳基金(L2010627)

110840 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科(李宏宇、郭曉鐘、劉旭、吳春燕、趙佳鈞)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科(李建軍、陳延志)

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com

2011-04-27)

(本文編輯：呂芳萍)