病毒核酸聯(lián)合抗心肌抗體檢測(cè)對(duì)病毒性心肌炎診斷的意義

曹悅?cè)?，張淑芹，劉志屹，吳金義

（1.長(zhǎng)春師范學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130032；2.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033）

病毒性心肌炎是由多種因素引起的，病毒感染是其發(fā)病的直接誘因。目前，已知近30多種病毒可引起病毒性心肌炎，其中以柯薩奇B組病毒為主。病毒感染機(jī)體后導(dǎo)致心肌損傷，導(dǎo)致心肌成分在血液循環(huán)中暴露，產(chǎn)生相應(yīng)的心肌抗體。而心肌抗體的產(chǎn)生又會(huì)加重心肌的損傷。本文對(duì)500例疑似病毒性心肌炎患者血清進(jìn)行了柯薩奇B組病毒核酸以及抗心肌抗體的檢測(cè)與分析，為病毒性心肌炎的診斷與治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人羊膜細(xì)胞，柯薩奇B組病毒1－6型標(biāo)準(zhǔn)株（本室保存）。

1.2 病例來(lái)源 2011年1－9月份經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院診斷的疑似病毒性心肌炎患者500例。其中病程少于2周者103人，病程介于2－4周之間者254人，病程超過(guò)4周以上者143人?；颊叱３Ｏ扔邪l(fā)熱，全身倦怠、惡心、嘔吐等感冒癥狀，然后出現(xiàn)心悸、胸痛、呼吸困難，心動(dòng)過(guò)速、心律失常等體征。心電圖可見(jiàn)ST－T改變，R波減低、房室傳導(dǎo)阻滯以及室性早搏。血清學(xué)檢查CPK、GOT、LDH增高，血沉加快，白細(xì)胞增多。健康對(duì)照組100例，來(lái)自健康普查人群。

1.3 試劑和儀器 Trizol裂解液、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、PstⅠ、NcoⅠ、ScaⅠ和SphⅠ均購(gòu)于美國(guó)GIBCO／BRL公司；TagDNA 聚合酶，購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；NCPCO二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)醫(yī)療儀器公司；冷凍高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)SIGMA公司；PCR儀購(gòu)于日本ASTZC公司。IX71組織顯微鏡，日本；電泳儀，BIO－RAD。Tanon－2500R型凝膠成像儀，上海天能科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)：上游引物 B5P2：5＇－CGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTT－3＇，下 游 引 物 B3P：5’－TCAATTGTCACCATA－AGCAGCCA－3’，這對(duì)引物用于擴(kuò)增柯薩奇B1－B6型病毒第64－610位核苷酸，擴(kuò)增產(chǎn)物為547 bp。

1.5 病毒核酸檢測(cè) 按文獻(xiàn)［1］常規(guī)方法對(duì)樣本進(jìn)行RT－PCR，然后按照文獻(xiàn)［2］選擇先前設(shè)計(jì)的一種以NEBuffer2為基質(zhì)的 HindⅢ、PstⅠ、NcoⅠ、ScaⅠ和SphⅠ混合內(nèi)切酶檢測(cè)溶液，將待測(cè)樣品的cDNA在NEBuffer2中被這5種限制性內(nèi)切酶切割，然后將酶切后產(chǎn)物的電泳圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比分析。

1.6 抗心肌抗體的檢測(cè) 以小鼠心肌組織冷凍切片作為抗原基質(zhì)的間接免疫熒光法［3］進(jìn)行，結(jié)果鑒定以肌纖維膜以及肌纖維束肌漿呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光者為陽(yáng)性。

1.7 分析軟件 利用美國(guó)Auelrys Inc公司的GCG軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒性心肌炎患者柯薩奇B組病毒及抗心肌抗體的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，500例疑似病毒性心肌炎患者血清中柯薩奇B組病毒的感染率為62.2%，其中B1感染率為1%，B2感染率為0，B3感染率為26.4%，B4感染率為18.2%，B5感染率為14.8%。B6感染率為1.8%，健康對(duì)照組的感染率僅為13%，并且都是B3感染率最高，B4、B5次之；500例疑似病毒性心肌炎患者血清中的抗心肌抗體的陽(yáng)性率為46.7%，健康對(duì)照組的陽(yáng)性率為7%，患病組與對(duì)照組比較，差異顯著。

2.2 柯薩奇B組病毒核酸檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本中抗心肌抗體的檢測(cè)結(jié)果 如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒感染的患者抗心肌抗體的檢出率很高，平均可達(dá)到71.4%，病毒感染的病程不同，抗心肌抗體的檢出率有所不同，病毒感染期小于2周的患者，其抗心肌抗體的檢出率為40.3%，病毒感染期在2－4周之間的患者，其抗心肌抗體的檢出率為70%，病毒感染期在超過(guò)4周的患者，其抗心肌抗體的檢出率為90.8%，表明抗心肌抗體的陽(yáng)性率隨著病程的延長(zhǎng)而增高。

表1 病毒性心肌炎患者血清柯薩奇B組病毒及抗心肌抗體的檢測(cè)結(jié)果

表2 柯薩奇B組病毒核酸檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本中抗心肌抗體的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

病毒性心肌炎是多種嗜心性病毒感染心肌后引起的心臟實(shí)質(zhì)或間質(zhì)、局限性或彌漫性病變，其中柯薩奇B組病毒感染占病毒性心肌炎總數(shù)的50%以上。發(fā)病的年齡從胎兒、新生兒、一直到兒童和青少年等各個(gè)階段。但是，患者絕大多數(shù)為兒童和青壯年，并且發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)［4］。

病毒性心肌炎的診斷目前仍以臨床表現(xiàn)為主，并以心電圖作為常規(guī)檢查協(xié)助診斷。血液檢查是以心肌酶譜作為心肌損傷的相關(guān)指標(biāo)。病毒性心肌炎的急性期AST升高。1－2周開(kāi)始升高，2－4周升高明顯，可持續(xù)4－8周。LDH在心肌炎發(fā)病15 d內(nèi)升高，后逐漸恢復(fù)正常。CK及CK－MB在心肌炎發(fā)病1－2周活性升高，3－5周逐漸下降。其中以CK、CK－MB敏感性和特異性最高，但如果病毒性心肌炎病變?yōu)榫衷钚?，心肌壞死量小，則心肌酶譜變化較輕或不發(fā)生改變，而且心肌酶譜的變化缺乏足夠的靈敏度和特異性，易造成漏診或誤診［5］。

心肌抗體是心肌受累的標(biāo)志。是心臟疾患時(shí)產(chǎn)生的自身抗體，是免疫機(jī)能介導(dǎo)、參與的病理過(guò)程。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，病毒性心肌炎患者血清抗心肌抗體的陽(yáng)性率與患病病程密切相關(guān)［6］。我們的研究結(jié)果也表明，柯薩奇B組病毒感染患者的抗心肌抗體陽(yáng)性率很高，并且隨著病程的延長(zhǎng)，陽(yáng)性率逐漸增高。這可能與病毒持續(xù)感染，導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡所致。因此，抗心肌抗體的檢測(cè)，不僅可以監(jiān)測(cè)病情，還有助于判斷預(yù)后。

病毒核酸檢測(cè)一種靈敏度高，重現(xiàn)性好的檢測(cè)方法。是在RT－PCR的基礎(chǔ)上，利用特定的5種限制性內(nèi)切酶對(duì)所獲得的目的cDNA進(jìn)行酶切消化，將酶切產(chǎn)物的電泳圖譜和柯薩奇B組病毒1－6型的標(biāo)準(zhǔn)酶切圖譜進(jìn)行分析和對(duì)比，可以很容易地對(duì)感染的病毒及型別進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒別。它不需要對(duì)每一個(gè)病毒型別都設(shè)計(jì)一對(duì)引物，只需要對(duì)病毒cDNA上共同的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后通過(guò)RTPCR方法將柯薩奇B組病毒的RNA反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增成大量的特定cDNA，再進(jìn)行酶切鑒定。因此，它既綜合了常規(guī)PCR的靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，在病毒感染2－3天即可檢測(cè)到病毒核酸?？勺鳛椴《靖腥驹缙谠\斷的依據(jù)。同時(shí)又解決了RT－PCR技術(shù)中非特異性高的難題，是一種更加適用、更加精確的檢測(cè)方法。為病毒性疾病的早期診斷提供可靠的理論依據(jù)［7.8］。

本文對(duì)500例疑似病毒性心肌炎患者標(biāo)本進(jìn)行柯薩奇B組病毒核酸以及抗心肌抗體檢測(cè)，其中病毒陽(yáng)性者311例，陽(yáng)性率為62.2%，與正常對(duì)照組比較具有顯著性差異；說(shuō)明病毒性心肌炎大多是由柯薩奇B組病毒引起，其中CVB3陽(yáng)性率最高，CVB4、CVB5次之，這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相一致。而抗心肌抗體檢測(cè)陽(yáng)性者233例，陽(yáng)性率為46.7%。并且在311例病毒檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中，抗心肌抗體檢測(cè)陽(yáng)性者222例，平均陽(yáng)性率為71.4%。而且病程越長(zhǎng)，陽(yáng)性率越高，說(shuō)明病毒的持續(xù)感染是造成心肌損傷的重要因素。

綜上所述，病毒性心肌炎的血液檢查中，除了心肌酶的檢測(cè)外，加以病毒核酸以及抗心肌抗體的檢測(cè)，對(duì)病毒性心肌炎的早期診斷、治療和預(yù)后研判具有重要意義。

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