應(yīng)用MTT檢測(cè)乙酰唑胺對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用

王艷麗，張小猛

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦 產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng) 春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼 科，吉林 長(zhǎng) 春130041）

卵巢癌患者大多伴有大量腹水，目前其病理機(jī)制尚不完全清楚。水通道蛋白1（AQP1）是Agre最早發(fā)現(xiàn)的水通道，它分布廣泛，具有特異轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，目前已成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)［1］。AQP－1與卵巢腫瘤的關(guān)系國(guó)內(nèi)外至今尚無(wú)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 試劑與方法

IMDM培養(yǎng)液，Hanks液，PBS、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胎牛血清、均購(gòu)自Sigma公司；AQP1原位雜交試劑盒、凋亡原位末端標(biāo)記檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自博士德生物技術(shù)公司。MTT購(gòu)自鼎國(guó)生物試劑有限公司。人卵巢癌細(xì)胞株由大連醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)。乙酰唑胺購(gòu)自Sigma公司方法：將卵巢癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，用96孔塑料板，每孔接種細(xì)胞懸液50μl；實(shí)驗(yàn)組加入乙酰唑胺50 μl使藥物終濃度分別為1×10－8mol／L、5×10－8mol／L、10×10－8mol／L（各三孔）；對(duì)照孔不加藥（三孔）；調(diào)零孔均加培養(yǎng)液（三孔）。以下按常規(guī)MTT法進(jìn)行。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

用MR700型酶標(biāo)定量?jī)x在試驗(yàn)波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)為450 nm下測(cè)定光密度值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值×100%，結(jié)果見表1，圖1。

表1 細(xì)胞存活率

圖1 細(xì)胞存活率

三條曲線分別代表不同培養(yǎng)濃度的實(shí)驗(yàn)組，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均下降，1×10－8mol／L時(shí)細(xì)胞存活率總體趨勢(shì)雖下降，但48 h時(shí)稍稍上升，考慮人為操作誤差。5×10－8mol／L和10×10－8mol／L細(xì)胞存活率明顯下降，10×10－8mol／L在48 h和72 h數(shù)值基本相同，考慮細(xì)胞存活率沒有明顯變化。

3 討論

1988年Agre等在鑒別人類Rh血型抗原時(shí)偶然在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了1種新的跨膜蛋白［1］。1991－1992年Agre等又完成了該蛋白的分子克隆和功能鑒定，證明該蛋白具有水通道功能，從而確認(rèn)了細(xì)胞膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)水的水通道蛋白的理論［2］。這種新的跨膜蛋白分子量為2.8×103，于1997年被正式命名為水通道蛋白1（AQP1）.隨后，在許多動(dòng)、植物及微生物中相繼發(fā)現(xiàn)水通道蛋白。目前哺乳動(dòng)物的組織中已經(jīng)鑒定11種水通道白（AQP0－AQP10），廣泛分布于各種組織和器官，在維持機(jī)體的水平衡中起著重要的作用，且與水平衡紊亂所造成的一些疾病密切相關(guān)，其中以AQP1分布最廣，作用最多。

AQP1廣泛分布于機(jī)體，特別是那些與液體吸收和分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中，AQP1只允許水自由雙向的穿過細(xì)胞膜，不轉(zhuǎn)運(yùn)離子，質(zhì)子等［3］。研究發(fā)現(xiàn)：多種腫瘤組織亦表達(dá)AQP1，可能與腫瘤細(xì)胞的起源，生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［4，5］。此外，在微血管內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)AQP1的高度表達(dá)，推測(cè)AQP1的高表達(dá)也可能與腫瘤的血管新生有關(guān)［6－8］。

四唑鹽是一種能接受氫離子的染料，化學(xué)名是3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍(lán)，簡(jiǎn)稱為MTT。MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率的機(jī)制是MTT在活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下還原成難溶性藍(lán)色的甲潛（formazan），而死亡細(xì)胞卻不能，細(xì)胞存活越多，藍(lán)色產(chǎn)物在酶標(biāo)儀上檢測(cè)的OD值就越大。本研究應(yīng)用MTT法通過檢測(cè)細(xì)胞存活率來間接檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，可以從另一個(gè)角度來檢測(cè)乙酰唑胺對(duì)AQP1的抑制作用。結(jié)果顯示：1×10－8mol／L組分別和5×10－8mol／L組、10×10－5mol／L組相比，差異均有顯著性（P＜0.05）。5×10－8mol／L組和10×10－5mol／L組之間差異沒有顯著性（P＞0.05）。在24 h與72 h之間比較，差異有顯著性（P＜0.05）。24 h與48 h之間，48 h與72 h之間差異沒有顯著性（P＞0.05）。證明乙酰唑胺對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞AQP1的抑制作用與時(shí)間、濃度有一定的關(guān)系但是具體的相關(guān)性還需進(jìn)一步證明。實(shí)驗(yàn)組在藥物濃度為1×10－8mol／L時(shí)，細(xì)胞存活率總體趨勢(shì)是下降，但是48 h時(shí)有一個(gè)上升，考慮實(shí)驗(yàn)中有很多因素包括人為因素引起的誤差，考慮該點(diǎn)的上升為實(shí)驗(yàn)的偶然性。實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為10×10－8mol／L時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，24 h與48 h之間細(xì)胞存活率有明顯變化，但是48 h與72 h之間細(xì)胞存活率沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)組在藥物濃度為5×10－8mol／L時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率明顯下降，即細(xì)胞凋亡率明顯上升，所以原位末端標(biāo)記法和逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)方法均采用該濃度為實(shí)驗(yàn)組。

本實(shí)驗(yàn)證明了應(yīng)用乙酰唑胺可以抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)，推測(cè)應(yīng)用AQP抑制劑可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，至少可能部分抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，希望通過開發(fā)應(yīng)用水通道蛋白抑制劑來治療腫瘤。

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