社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的同源性及PVL毒素研究

潘宏升，荀鳳嬌，田素飛，年 華，褚云卓＊

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng)110001；2.遼寧省第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科）

目前，全球范圍內(nèi)由社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趨勢(shì)，CA－MRSA與醫(yī)院相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（HA－MRSA）存在許多不同，CA－MRSA多感染無(wú)相關(guān)危險(xiǎn)因素的健康人群，且發(fā)病年齡較輕［1］；其常攜帶多種與致病力相關(guān)的外毒素，其中殺白細(xì)胞（PVL）毒素被證實(shí)能夠引起壞死性筋膜炎、敗血癥、中毒休克綜合征等多種進(jìn)行性、壞死性疾病［2］，嚴(yán)重者甚至死亡。因此，有必要對(duì)CA－MRSA進(jìn)行毒力檢測(cè)及同源性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2007年1月至2008年9月門診及住院患者連續(xù)分離、不重復(fù)非痰標(biāo)本CAMRSA菌株5例，其中濃汁3份，血液2份。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒，博日生物技術(shù)有限公司；Taq酶及PCR相關(guān)試劑，寶泰克大連生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脈沖場(chǎng)凝膠電泳試劑，美國(guó)Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀（美國(guó)Bio－Rad），HZQ－F160振蕩培養(yǎng)箱（上海）；超速低溫離心機(jī)（貝克曼）；紫外凝膠成像儀（美國(guó)Alpha Innotech）。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，按照說(shuō)明提取基因組DNA。

1.2.2 PVL基因檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)及參數(shù)參照文獻(xiàn)［3］，上 游 引 物：5’－ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA－3’，下 游：5’－GCAT－CAACTGTATTGGATAGCAAAAGC－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，片段大小與預(yù)計(jì)值相符，產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司純化、測(cè)序，在GenBank比對(duì)確證。

1.2.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析 新鮮菌株包埋于1%低熔點(diǎn)瓊脂中，溶葡球菌素及溶菌酶進(jìn)行破壁（37℃，2h），蛋白激酶 K原位消化（50℃，48h），經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI酶切（25℃、140r／min，4h）；參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng)度6V／cm，溫度14℃，角度120°，脈沖時(shí)間5－40s，電泳22h，EB染色20min，分析結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：酶切后圖譜完全一致為A型；圖譜與A比較，3條帶差異以下者為同一型的不同亞型，4－6條者為不同基因型。

2 結(jié)果

2.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果

3株SCCmec基因型Ⅳ型菌株為同一克隆株A型，2株Ⅴ型菌株分別為A1、A2亞型，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 脈沖場(chǎng)電泳結(jié)果

2.2 PVL基因檢測(cè)

結(jié)果顯示3株SCCmecⅣ型CA－MRSA分離株P(guān)VL基因陽(yáng)性（其測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2）。

圖2 PVL基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

自從1997年在紐約首次發(fā)現(xiàn)社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染以來(lái)，全球范圍內(nèi)關(guān)于CA－MRSA感染的報(bào)道接連不斷，其較強(qiáng)的傳播能力和定植能力及其攜帶的毒力基因?qū)τ诩膊〉陌l(fā)生、發(fā)展都起到了十分重要的作用，使其易造成感染的暴發(fā)和流行，引起發(fā)病率和死亡率升高。

PFGE方法是進(jìn)行染色體DNA分型，將基因組的整體基因片段進(jìn)行分析，主要應(yīng)用于近期內(nèi)引發(fā)感染疾病的菌株間同源性分析，其分辨能力強(qiáng)，被譽(yù)為基因分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究發(fā)現(xiàn)，3例CA－MRSA菌株（P14、2997、E14）PFGE圖譜一致，其余2株為該型的不同亞型，具有高度的同源性。

雖然文獻(xiàn)［4］顯示C A－MRSA在基因結(jié)構(gòu)上僅攜帶對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的mecA基因耐藥程度較低，但與HA－MRSA不同攜帶多種毒素，其獨(dú)力更強(qiáng)，本研究顯示5株CA－MRSA中有3株攜帶PVL毒素，遠(yuǎn)高于 HA－MRSA［5］。應(yīng)引起臨床廣泛注意。

［1］Jenum PA，Walberg M，R?nning EJ，et al.An outbreak of methicillin－resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward［J］.Tidsskr Nor Laegeforenk，2008，17；128（8）：933.

［2］Delaney JA，Schneider－Lindner V，Brassard P，et al.Mortality after infection with methicillin－resistant Staphylococcus aureus（MRSA）diagnosed in the community［J］.BMC Med，2008，6：2.

［3］Vandenesch F，Naimi T，Enright MC，et al.Community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus carrying Panton Valentine leukocidi genes：world wide emergence［J］.Emerg Infect Dis，2003，9：978.

［4］Gorwitz，RJ，Jernigan，DB，Powers，JH，et al.In the CDC－Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community：summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention［G］.

［5］Gillet Y，Issartel B，Vanhems P.Association between Staphylococcus aureus strains carrying the gene for Panton-Valentine leukocidin and hightly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients［J］.Lancet，2002，359：753.