紫杉醇聯(lián)合放療對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞株凋亡蛋白表達(dá)的影響

楊永凈，劉士新，刁建東，曹 玲，柳群麗

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院 放療一科，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科）

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在頭頸部惡性腫瘤中占首位。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，早期病人單純放療效果較好，但因其發(fā)生部位隱蔽，癥狀多樣性，就診病人70%為局部晚期病人，單純放療療效較差，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為常見的失敗原因。為提高局部晚期鼻咽癌的治療效果，局部放療和全身化療相結(jié)合成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇可使細(xì)胞周期阻滯于G2／M 期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞再氧合，而處于G2／M期的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感。本研究應(yīng)用紫杉醇聯(lián)合放療對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞株凋亡蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討紫杉醇對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放療增敏作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物和試劑

人鼻咽癌CNE細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，紫杉醇為山西普德公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司，胎牛血清購自天津TBD公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)條件

人鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的PRMI－640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞總蛋白的提取

將對(duì)數(shù)生長期的鼻咽癌CNE細(xì)胞隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理，給予等體積PBS）；放療組（細(xì)胞以6Gy劑量進(jìn)行照射）；紫杉醇組（細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇）；放療聯(lián)合紫杉醇組（細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇后，以6Gy劑量進(jìn)行照射），將分組后的細(xì)胞株培養(yǎng)24h后，冷PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的蛋白裂解液100μl，置于4℃搖床，溫和振蕩15min，14 000rpm，4℃離心15 min，取上清為全蛋白提取物。

1.4 BCA法蛋白定量

根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分混勻；以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度（2000、1000、750、500、250、125、62.5、31.25μg／μl）標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10μl置于EP管中；取不同轉(zhuǎn)染組蛋白提取物各10μl，至于不同EP管中；各管加入200μl BCA工作液；各管充分混勻，37℃放置30min，然后在562nm下比色測定；以BSA蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白含量（μg）；按相同蛋白濃度，分裝蛋白，－70℃保存。

1.5 SDS－PAGE

分別取上述分離總蛋白按4∶1比例加入5×SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸3－5min；取出樣品，冷卻至室溫后，離心（10 000rpm）30s，取上清每孔加樣30μl；40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到100V，恒壓電泳至分離膠底部。

1.6 轉(zhuǎn)膜

剪6塊3mm濾紙和一塊PVDF膜，大小與膠相同；將剪好的膜在100%甲醇中短暫浸泡后，再在電轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡平衡10－15min；濾紙用電轉(zhuǎn)液浸泡；待電泳結(jié)束后，取下凝膠，切去積層膠作標(biāo)記，電轉(zhuǎn)緩沖液漂洗膠并平衡20min。然后按以下順序安裝：陽極側(cè)－海綿－3張濾紙－NC膜－凝膠－3張濾紙－海綿－陰極側(cè)。放置每一層時(shí)，均要去除各層間的氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果；用塑料支架夾緊上述各層，置于轉(zhuǎn)移電泳儀內(nèi)，以恒流200mA轉(zhuǎn)移2h；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下PVDF膜，用鉛筆在膜的上緣作好標(biāo)記。將膜置于平皿中，加入TBST室溫漂洗10 min。

1.7 免疫結(jié)合

封閉：將上述PVDF膜放于平皿中，加入20ml封閉液（5%脫脂奶粉），室溫輕輕振蕩1h；TBST室溫漂洗2次，5－10min／次；用抗體稀釋液?。ê?%脫脂奶粉的TBST）釋一抗（鼠抗人caspase3抗體、鼠抗人NF－κB抗體）至1∶500；封閉結(jié)束后，PVDF膜放入一雜交袋中，按0.1ml抗體溶液／cm2膜加入抗體，去除氣泡，封口，4℃過夜；一抗中取出，TBST漂洗，10min／次，3－5次；用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體至1∶5000，加入雜交袋中，室溫振蕩1－2h；TBST 漂洗，10min／次，3－5次。

1.8 曝光成像

配制ECL發(fā)光工作液；取出洗滌的PVDF膜，在濾紙上瀝干洗液，然后將膜完全浸入并與發(fā)光工作液充分接觸，室溫孵育1min；瀝干發(fā)光工作液，放入X光片暗盒內(nèi)曝光；顯影沖洗。

2 結(jié)果

放療組、紫杉醇組和放療聯(lián)合紫杉醇組caspase3表達(dá)高于空白對(duì)照組，放療聯(lián)合紫杉醇組組升高明顯。與此相對(duì)應(yīng)，放療組、紫杉醇組、放療聯(lián)合紫杉醇組NF－κB表達(dá)下降，其中放療聯(lián)合紫杉醇組降低顯著，說明放療對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，而小劑量的紫杉醇增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。見圖1，2。

圖1 鼻咽癌CNE細(xì)胞株caspase3蛋白免疫印跡分析

圖2 鼻咽癌CNE細(xì)胞株NF－κB蛋白免疫印跡分析

3 討論

局部晚期鼻咽癌治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前國內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道誘導(dǎo)化療與輔助化療對(duì)降低局部晚期鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和提高局部晚期鼻咽癌總生存率沒有實(shí)質(zhì)性的改善。同期放化療不但增加局部療效且可以減少或消滅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療局部晚期鼻咽癌的效果較好，能夠提高局部晚期鼻咽癌的生存率已成共識(shí)［1，2］。

紫杉醇是一種新型的微管穩(wěn)定劑，具有獨(dú)特抗癌活性，能加快微管蛋白聚合，延緩微管解聚，形成穩(wěn)定的非功能性的微管束，從而破壞有絲分裂和細(xì)胞增殖。研究表明其不但能殺滅腫瘤細(xì)胞，控制微小的亞臨床轉(zhuǎn)移灶，降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，同時(shí)可作為放射增敏劑提高腫瘤的放射敏感性，與放療具有協(xié)同作用［3］。劉君等［4］用低濃度（4 ×102mmol／L）的紫杉醇作用于喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep22 12 h或24h后再給予2Gy劑量（直線加速器）進(jìn)行照射比單純放療或單用紫杉醇能更明顯地抑制細(xì)胞的生長，而單獨(dú)使用2Gy劑量的照射并不能顯著抑制細(xì)胞的生長，初步說明了紫杉醇能起到放療增敏的作用。

本研究前期結(jié)果表明紫杉醇聯(lián)合放療組腫瘤抑制率明顯高于放療組及紫杉醇組，流式細(xì)胞檢測紫杉醇可將細(xì)胞周期阻滯于G2／M 期，顯著阻滯了細(xì)胞的周期進(jìn)展，從而增強(qiáng)了抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。除上述機(jī)制外，本研究結(jié)果表明紫杉醇聯(lián)合放療可影響凋亡蛋白Caspase－3、NF－κB的表達(dá)，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，Caspase－3在細(xì)胞中以酶原方式存在，凋亡信號(hào)激活上游Caspase進(jìn)而激活下游Caspase－3，在凋亡執(zhí)行階段由下游Caspase－3對(duì)特定的底物進(jìn)行切割，激活核纖層蛋白、肌動(dòng)蛋白等蛋白酶及核酸內(nèi)切酶等，抑制DNA修復(fù)酶從而破壞細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白，使染色體斷裂成小片段，這些不可逆轉(zhuǎn)的改變導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5］。Caspase－3是細(xì)胞凋亡信號(hào)中最關(guān)鍵因子之一，在Caspase－3家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，最后均通過激活Caspase－3使細(xì)胞進(jìn)入凋亡。NF－κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合并調(diào)節(jié)κ輕鏈轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子，NF－κB在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，NF－κB的活性不僅參與了淋巴瘤和骨髓瘤的發(fā)生，也存在于多種實(shí)體瘤中［6］。實(shí)驗(yàn)證明化療藥物引起NF－κB活化能抑制細(xì)胞死亡，是腫瘤臨床治療中耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素［7］。NF－κB活化可抑制細(xì)胞死亡，因此NF－κB被認(rèn)為是抗凋亡因子，大量的研究結(jié)果表明抑制NF－κB活性可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡或使細(xì)胞恢復(fù)凋亡現(xiàn)象［8］。

本研究結(jié)果表明紫杉醇組、放療組及紫杉醇聯(lián)合放療組鼻咽癌CNE細(xì)胞株Caspase－3表達(dá)均較對(duì)照組增加，NF－κB表達(dá)均較對(duì)照組下降，尤以紫杉醇聯(lián)合放療組為著，提示紫杉醇影響凋亡蛋白的表達(dá)可能是其放療增敏作用的機(jī)制之一。

［1］Wee J，Tan EH，TaiBC，et al.Randomized trial of radiotherapy versus concurrent chemoradiotherapy followed by adjuvant chemotherapy in patients with American Joint Committee on Cancer／In ternational Union against cancer stageⅢandⅣnasopharyngeal cancer of the endemic variety［J］.J Clin Oncol，2005，23（27）：6730.

［2］Zhang L，Zhao C，Peng PJ，et al.PhaseⅢ study comparingstandard radiotherapy with or without weekly oxalip latin in treatment of locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma：Preliminary results［J］.J Clin Oncol，2005，23（33）：8461.

［3］Lee N，Xia P，Quivey J M，et al.Intensity modulated radiotherapy in the treatment of nasopharyngeal carcinoma［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，53：12.

［4］劉 君，王家東.紫杉醇聯(lián)合直線加速器放射對(duì)喉癌細(xì)胞作用的研究［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2002，16（9）：481.

［5］Worf BB，Green DR.Suicidal Tendencies：Apoptotic Cell Death by Caspase －Family Proteinase［J］.J Biol Chem，1999，274（29）：20049.

［6］Radhakrishnan SK，Kamalakaran S.Pro－apoptotic role of NF－kappaB：implications for cancer therapy［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：53.

［7］Wang CY，Mayo MW，Baldwin AS Jr.TNF－and cancer therapyinduced apoptosis：potentiation by inhibition of NF－kappaB［J］.Science，1996，274（5288）：784.

［8］Nakanishi C，Toi M.Nuclear factor－kappaB inhibitors as sensitizers to anticancer drugs［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（4）：297.