大孔樹脂吸附分離紫蘇莖總黃酮的工藝研究

吳元鋒，孟耀庭，毛建衛(wèi)，黃 俊，劉士旺

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023）

紫蘇（Pefilla frutescens（L.）Britt）別名赤蘇、紅蘇、紅紫蘇、香蘇，系唇形科紫蘇屬一年生草本植物，目前中國(guó)各地均有栽培，主產(chǎn)于江蘇、安徽、湖南等地，分布于全國(guó)20多個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），具有極為廣泛的資源價(jià)值，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食植物，且富含黃酮類化合物［1］。紫蘇葉、莖、籽可分別入藥，藥效各有不同，紫蘇葉具有解表散寒，行氣和胃功效；紫蘇梗具有理氣寬中，止痛，安胎功效；紫蘇籽具有降氣消痰，平喘，潤(rùn)腸功效［2］。李秀信的實(shí)驗(yàn)表明，紫蘇莖中含有黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類和二氫黃酮醇類等多種黃酮類化合物［3］。

國(guó)內(nèi)已有學(xué)者對(duì)大孔樹脂吸附純化紫蘇總黃酮［4］、紫蘇葉總黃酮［5］、白蘇的地上部分總黃酮［6］等工藝進(jìn)行了研究。本研究以紫蘇莖總黃酮為原料，選用5種不同類型的吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、ADS-7和ADS-17進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)靜態(tài)吸附篩選出最適合紫蘇莖總黃酮純化的大孔樹脂，然后對(duì)上樣總黃酮質(zhì)量濃度、上樣速率、解吸濃度、洗脫速率等進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，得出優(yōu)化的分離工藝，為大孔樹脂吸附分離紫蘇莖總黃酮奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外現(xiàn)代分光光度計(jì)，RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵，數(shù)顯恒溫水浴鍋，自動(dòng)部分收集器，電子天平，GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

1.1.2 材料與試劑

原料：紫蘇莖，產(chǎn)自浙江衢州。

標(biāo)準(zhǔn)品：二水櫟精（純度98%），購(gòu)自上海阿拉丁。

主要試劑：無(wú)水乙醇、冰醋酸、石油醚、醋酸鈉、無(wú)水三氯化鋁均為分析純。

大孔樹脂：D-101、AB-8、DM130、ADS-7、ADS-17，購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提物的制備

粉碎干燥紫蘇樣品，以60%乙醇為提取劑，料液比為1∶30，提取時(shí)間為60min，提取溫度50℃，進(jìn)行超聲波輔助提取，得到紫蘇提取液，將紫蘇提取液濃縮得浸膏。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用氯化鋁法：二水櫟精標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）用50%乙醇配成0.1mg／mL溶液，分別精密吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于25mL容量瓶中，加8mL1.5%三氯化鋁溶液與4mL pH 5.5的醋酸鈉緩沖液，然后用50%乙醇溶液定容，靜置0.5h后，于紫外分光光度計(jì)415nm處測(cè)定，得回歸方程Y＝0.519 6 X＋0.033 1，R2＝0.995 2。

1.2.3 樹脂靜態(tài)吸附量及解吸率的測(cè)定

三角瓶中加入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101、AB-8、DM130、ADS-17和ADS-7大孔樹脂各2g，加入質(zhì)量濃度為0.46mg／mL的紫蘇黃酮提取液各30mL，置于25℃搖床上震蕩24h后測(cè)溶液未被吸附的黃酮含量，按下式計(jì)算靜態(tài)吸附量：

式中：A1—黃酮吸附量，mg／g；C0、C1—初始、殘余黃酮質(zhì)量濃度，mg／mL；V—料液體積，mL；W—大孔樹脂質(zhì)量，g。

根據(jù)樹脂的吸附量，選擇2種吸附率較大的樹脂，加入70%的乙醇后放入搖床解吸，根據(jù)下式計(jì)算解吸率：

式中：A2—解析率；C2、C3—吸附飽和時(shí)，解吸液黃酮質(zhì)量濃度，mg／mL。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線

大孔樹脂濾至沒(méi)有水流出，精確稱取2g大孔樹脂放入100mL三角瓶中，加入30mL紫蘇莖總黃酮提取液（質(zhì)量濃度為0.46mg／mL），放入25℃搖床中進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，每1h吸取1mL溶液，分光光度法測(cè)定溶液中黃酮含量，共吸附12h，得出大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線。

1.2.5 大孔樹脂吸附紫蘇莖總黃酮工藝的確定

1.2.5.1 上樣黃酮質(zhì)量濃度對(duì)吸附的影響 分別配制質(zhì)量濃度為0.46、0.15、0.05mg／mL的黃酮溶液，大孔樹脂濕法裝柱，用大量水淋洗后分別上樣3種不同質(zhì)量濃度黃酮溶液，每1柱床體積（BV）收集1瓶，上樣流速為1BV／h，直至流出液黃酮質(zhì)量濃度為上樣液的1／10（即穿透）。

1.2.5.2 上樣流速對(duì)吸附的影響 選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.15mg／mL，依次用0.6、1、2BV／h流速上樣，測(cè)定流出液黃酮質(zhì)量濃度，直至流出液黃酮質(zhì)量濃度為上樣液的1／10。

1.2.5.3 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫的影響 大孔樹脂經(jīng)過(guò)紫蘇黃酮吸附飽和后，分別用50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫，流速為1BV／h，分別測(cè)定流出液黃酮質(zhì)量濃度，得出解吸曲線。

1.2.5.4 乙醇洗脫速率對(duì)洗脫的影響 大孔樹脂經(jīng)過(guò)紫蘇黃酮吸附飽和后，分別以1BV／h、2BV／h、3BV／h流速洗脫，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%，分別測(cè)定流出液黃酮質(zhì)量濃度，得出解吸曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂對(duì)紫蘇莖總黃酮的吸附量

按1.2.3方法，分別計(jì)算出5種大孔樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附量，結(jié)果見(jiàn)表1。

由于大孔樹脂極性、孔徑、比表面積、孔容等不同，故不同的大孔樹脂對(duì)吸附分離的影響很大。在所選擇的5種大孔樹脂中，D-101是非極性，AB-8是弱極性，DM130是中等極性，ADS-7和ADS-17是極性大孔樹脂。從表1可以看出，5種型號(hào)大孔樹脂中，以AB-8對(duì)吸附量最高，其次是D-101，這可能是由于AB-8是弱極性吸附樹脂，因此對(duì)于極性較弱的總黃酮有較好的吸附性能。非極性的D-101樹脂對(duì)總黃酮也有較好的吸附效果。而中等極性和極性的大孔樹脂對(duì)紫蘇黃酮吸附效果較差。在下面的解析率實(shí)驗(yàn)中，選取AB-8和D-101樹脂進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表1 大孔樹脂對(duì)紫蘇莖總黃酮的吸附量Table 1 Adsorption capacity of macroporous resin to total flavonids of stem of Pefilla frutescens

2.2 大孔樹脂對(duì)紫蘇莖總黃酮的解吸率

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中吸附飽和的AB-8、D-101大孔樹脂用70%乙醇解吸12h，其解吸率結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，從吸附量和解吸率來(lái)看，AB-8樹脂都優(yōu)于D-101樹脂。這是因?yàn)樽咸K莖總黃酮是弱極性物質(zhì)，在弱極性柱上更容易被吸附，同時(shí)可能是由于比表面積較大的原因，也較容易被洗脫，故解析率更高，因此在靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中，選擇AB-8為吸附樹脂。

表2 AB-8、D-101大孔樹脂的解吸率Table 2 Desorption capacity of macroporous resin AB-8and D-101

2.3 AB-8對(duì)紫蘇莖總黃酮靜態(tài)吸附曲線繪制

選擇AB-8大孔樹脂，按1.2.4方法，測(cè)定不同時(shí)間總黃酮濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線，如圖1所示。從圖1中可看出，總黃酮的初始質(zhì)量濃度為0.46mg／mL，1h后即降到0.29mg／mL，但此后吸收率變化開始變小，3h后吸附率基本趨于穩(wěn)定，吸附量不再明顯變化。

2.4 不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8吸附的影響

按1.2.5.1方法，試驗(yàn)不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8大孔樹脂吸附性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附性能的影響來(lái)看，上樣總黃酮質(zhì)量濃度為0.46mg／mL時(shí)，穿透點(diǎn)出現(xiàn)最早，在6BV附近即可穿透，此時(shí)總黃酮質(zhì)量濃度較高，可能造成大孔樹脂使用周期短，樹脂再生次數(shù)增多；而上樣總黃酮質(zhì)量濃度為0.05mg／mL時(shí)，穿透點(diǎn)出現(xiàn)最晚，在11BV附近才穿透，這將會(huì)使生產(chǎn)周期過(guò)長(zhǎng)；上樣總黃酮質(zhì)量濃度0.15mg／mL時(shí)，穿透點(diǎn)出現(xiàn)在8BV附近。因此，選擇最佳上樣質(zhì)量濃度為0.15mg／mL。

2.5 不同上樣速率對(duì)AB-8吸附性能的影響

進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.15mg／mL時(shí)，對(duì)不同上樣速率下進(jìn)行大孔樹脂吸附性能試驗(yàn)，3種不同上樣流速下的吸附性能如圖3所示。由圖3可知，上樣流速在0.6BV／h時(shí)，穿透點(diǎn)出現(xiàn)最晚，在11BV處才穿透；上樣流速為1BV／h時(shí)，穿透點(diǎn)在8BV處出現(xiàn)；而上樣流速為2BV／h時(shí)，6BV處即可實(shí)現(xiàn)穿透。黃酮溶液越慢通過(guò)樹脂柱，越能和樹脂充分接觸，從而提高吸附效果，但是流速慢會(huì)導(dǎo)致整個(gè)吸附時(shí)間大大延長(zhǎng)。而流速太快，導(dǎo)致穿透點(diǎn)過(guò)早出現(xiàn)，吸附效果也會(huì)變差，紫蘇莖總黃酮在樹脂上吸附量會(huì)變小。因此，從工業(yè)化生產(chǎn)成本上綜合考慮，取上樣流速為1BV／h，此時(shí)吸附效果較好，生產(chǎn)周期也較短。

2.6 不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)洗脫對(duì)AB-8洗脫性能的影響

按1.2.5.3方法，依次采用3種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)大孔樹脂進(jìn)行洗脫，解吸曲線見(jiàn)圖4。

從不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)洗脫效果的影響來(lái)看，總的效果是乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，總黃酮洗脫的速率越快，但差別不是很大。另外，還測(cè)定了3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇溶液的洗脫率，50%、70%、90%質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)總黃酮的洗脫率分別為87.79%、95.35%、91.56%。綜合來(lái)看差別不大，但是乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)選在70%稍好。

2.7 不同洗脫速率對(duì)大孔樹脂洗脫性能的影響

按1.2.5.4方法，選擇3種洗脫流速進(jìn)行洗脫，洗脫曲線如圖5所示。

從圖5中可以看出，洗脫速率越快，總黃酮出峰時(shí)間越早。洗脫流速為3BV／h時(shí)，洗脫體積為2 BV時(shí)黃酮質(zhì)量濃度即達(dá)到最大；洗脫流速為2BV／h時(shí)，對(duì)應(yīng)的洗脫體積為3BV；而洗脫流速為1BV／h時(shí)，洗脫體積為4BV后流出液總黃酮質(zhì)量才開始下降。另外，測(cè)定了3種洗脫流速下總黃酮的洗脫率，洗脫速率下為1、2、3BV／h時(shí)，AB-8大孔樹脂對(duì)總黃酮的洗脫率分別為95.35%、93.56%和76.67%。因此，洗脫速率為3BV／h時(shí)，出峰時(shí)間最短，但洗脫率最低；洗脫速率為1BV／h時(shí)，洗脫率最高，但是出峰時(shí)間最長(zhǎng)，而且拖尾嚴(yán)重，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。因此，選擇最佳洗脫速率為2BV／h。

2.8 大孔樹脂吸附后總黃酮純度比較

根據(jù)氯化鋁法測(cè)定吸附前后黃酮的含量，得出大孔樹脂吸附前紫蘇莖總黃酮純度為11.3%；經(jīng)過(guò)大孔樹脂吸附純化后的總黃酮純度為50.7%，說(shuō)明AB-8樹脂適合分離以紫蘇莖為原料提取得到的總黃酮。

圖5 不同洗脫流速對(duì)AB-8洗脫性能的影響Fig.5 Effect of elution rate on desorption capacity of macroporous resin AB-8

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究從吸附性能、上樣質(zhì)量濃度、上樣速率、洗脫濃度、洗脫速率等方面考察了紫蘇莖總黃酮的分離工藝。靜態(tài)吸附試驗(yàn)表明，AB-8大孔樹脂對(duì)紫蘇莖總黃酮的吸附量較高；動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)表明，上樣速率與上樣質(zhì)量濃度分別為1BV／h和0.15mg／mL，乙醇洗脫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%，洗脫速率為2BV／h時(shí)，總黃酮洗脫率為93.56%，總黃酮純度可提高4.5倍。

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