內毒素對人牙周膜細胞Toll樣受體2和Toll樣受體4表達的影響

段立立，許麗華，王 潔，楊冬茹，蔣強國

(河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，省口腔重點實驗室，河北石家莊 050017)

Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是天然免疫受體家族中的一員，通過識別病原體的病原相關分子模式(pathogen association molecular pattern，PAMP)，引起細胞內信號傳導，從而引起細胞因子分泌，啟動炎癥反應。牙周病是以G－厭氧菌為主的混合感染，內毒素(lipopolysaccharide，LPS)是其主要毒力因子，可穿過上皮進入深部的結締組織與TLR2和TLR4結合，促進牙周病的發(fā)生和發(fā)展。牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周膜內的主體細胞，具有較強合成膠原的能力，對牙周組織健康的維持以及牙齒的穩(wěn)固十分重要。PDLCs是否可以作為免疫細胞參與牙周組織的局部免疫反應是目前關注的熱點，本研究采用免疫細胞化學染色法檢測體外培養(yǎng)的PDLCs是否表達TLR2和 TLR4，同時觀察 LPS刺激不同時間對PDLCs表達TLR2和TLR4的影響，以期了解TLRs在牙周病中的免疫學作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)液(北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(浙江天杭科技有限公司);兔抗人TLR2多克隆抗體、兔抗人TLR4多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司);鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人角蛋白單克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);胰蛋白酶、MTT、DMSO(Sigma，美國);二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜(NUNR，美國);熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本);酶標儀(TECAV，奧地利);離心機、系列移液器(EPPENDORF，德國);細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(Coring Costar，美國);多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(Media Cyberneties，美國)。

1.2 PDLCs原代培養(yǎng)和鑒定

取12～26歲志愿者因正畸減數拔除的牙周組織健康的前磨牙，無菌濕潤條件下刮取根中1/3的牙周膜組織，采用組織塊法進行PDLCs的原代培養(yǎng)，待細胞從組織塊中爬出并鋪滿瓶底達80%時進行首次傳代。取第3代細胞進行免疫細胞化學染色，通過波形蛋白和角蛋白染色鑒定細胞來源。

1.3 PDLCs生長曲線的繪制

取第4代生長良好的處于對數生長期的PDLCs，用DMEM培養(yǎng)液制成4×104/mL的單細胞懸液后取接種于96孔板(共鋪7板，每板復種3孔，每孔200 μL，同時設不加細胞的調零孔，置于CO2培養(yǎng)箱內標準條件下進行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后 1、2、3、4、5、6、7 d，各取出 1 板，用四唑鹽比色法(Methlthazoletrazolium，MTT)檢測細胞生長情況，并繪制生長曲線。

1.4 檢測LPS刺激后TLR2和TLR4在PDLCs中的表達

取第4代生長良好的PDLCs以5×104/mL的密度接種于每孔底部放有圓形蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，加入適量DMEM培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱中標準條件下進行培養(yǎng)。待細胞均勻貼壁生長并基本鋪滿蓋玻片后，棄原培養(yǎng)液，實驗組加入含LPS終末濃度為10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液，對照組加入不含LPS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后 4、8、12、24 h，收集各組細胞爬片，丙酮固定，運用免疫細胞化學染色SP法檢測TLR2和TLR4在牙周膜細胞中的表達，一抗分別為兔抗人TLR2和TLR4多克隆抗體，抗體濃度為1∶100。以PBS代替一抗作為空白對照。

利用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)對染色標本進行圖像分析，每張爬片隨機選擇5個高倍視野(×400)，根據Soslow［1］的評分方法進行免疫組化評分(Immunohistochemical score，IHS)，分別計算TLR2和TLR4在各組各時間點的平均分值。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPASS 13.0軟件對所得數據進行單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PDLCs原代培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)的PDLCs以組織塊為中心呈放射狀排列，倒置顯微鏡下見細胞呈長梭形，有2～4個細胞突，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰，數量1～3個不等。免疫細胞化學染色結果顯示:體外培養(yǎng)的PDLCs均為抗波形蛋白染色陽性，陽性部位位于胞漿;抗角蛋白染色陰性，證實細胞來源于中胚層，符合成纖維細胞的生物學特性。

2.2 PDLCs生長曲線

取第4代PDLCs繼續(xù)培養(yǎng)，其生長曲線呈典型的“S”形，經歷了潛伏期、對數生長期和平臺期3個生長階段(圖1)。

圖1 PDLCs生長曲線

2.3 10 μg/mL LPS 對 PDLCS表達 TLR2 和 TLR4的影響

PDLCs爬片的免疫細胞化學染色結果顯示，TLR2和TLR4主要表達于細胞膜和細胞漿中，細胞核內不表達，陽性部位呈棕黃色(圖2～3)。

免疫組化評分(IHS)結果顯示，TLR2和TLR4表達情況相似，以PBS替代一抗的空白對照組染色均為陰性;無LPS刺激的對照組TLR2和TLR4均為為弱陽性;加入LPS后染色增強，且隨LPS刺激時間增加而增加，LPS刺激后各時間的TLR2和TLR4的HIS分值與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，PLS刺激后各時間點兩兩相比，除12 h組與24 h組無顯著性差異(P＞0.05)外，其他各時間點相比均有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

圖2 10 μg/mL LPS刺激后不同時間PDLCs表達TLR2的免疫細胞化學染色(SP×400)

圖3 10 μg/mL LPS刺激后不同時間PDLCs表達TLR4的免疫細胞化學染色(SP×400)

表1 10 μg/mL LPS刺激后各時間點TLR2和TLR4的IHS分值

表1 10 μg/mL LPS刺激后各時間點TLR2和TLR4的IHS分值

* 組間比較P＞0.05，其他各時間點間相比P＜0.05

指標 對照組 4 h組 8 h組 12 h組 24 h組TLR2 0.42 ±0.05 0.73 ±0.04 1.62 ±0.13 2.77 ±0.06* 2.81 ±0.05*TLR4 0.19 ±0.03 0.40 ±0.05 1.18 ±0.33 2.33 ±0.49* 2.48 ±0.45*

3 討論

TLRs是LPS跨膜信號轉導的模式識別受體，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)3部分組成。TLRs分布較廣泛，主要表達于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞表面，在內皮細胞、上皮細胞和成纖維細胞等非免疫細胞表面也有表達［2－3］。有研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌的LPS可通過牙齦成纖維細胞膜上的TLR4相結合而向胞內傳導，刺激牙齦成纖維細胞釋放炎癥因子，激活破骨細胞，引起牙槽骨吸收，從而促進牙周疾病的發(fā)生和發(fā)展［4］。亦有研究發(fā)現(xiàn)［5］慢性牙周炎病人唾液和血漿中TLR2、TLR4的表達水平均顯著增高。以上研究結果提示，TLR2和TLR4與牙周炎癥密切相關，存在于口腔內的病原體可引起TLRs信號傳導從而導致牙周炎的發(fā)生。

本結果顯示，無LPS刺激組PDLCs中TLR2和TLR4表達呈弱陽性，說明盡管牙周組織健康，PDLCs也可以表達TLR2和TLR4，可能是因為齦溝液中存在的少量LPS穿過溝內上皮和結合上皮進入深部的牙周膜組織，使部分PDLCs處于受刺激狀態(tài)并少量表達TLR2和TLR4，可能是PDLCs的一種自我防御功能的表現(xiàn)。而經LPS刺激后各組表達TLR2和TLR4顯著增強，表明PDLCs參與了牙周組織的局部免疫反應，LPS刺激可上調其TLR2和TLR4的表達。

本結果與一些學者的研究結果類似，Scheres等［6］通過體外培養(yǎng)的健康者和牙周炎者的PDLCs進行研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎組的PDLCs有TLR1、TLR4、TLR7和CD14的mRNA的高表達。吳安平等［7］報道，在健康PDLCs中有TLR4表達，牙齦卟啉菌的LPS可刺激牙周膜細胞TLR4基因的上調。Sun等［8］研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞經LPS刺激后，TLR4和IL－6表達明顯增加。以上研究結果提示，存在于口腔內的病原體可引起TLR4的信號傳導而導致牙周炎，牙周膜細胞參與牙周組織的免疫應答。

TLRs的信號傳導是一個非常復雜的過程，深入研究TLRs的配體識別、信號轉導等各個環(huán)節(jié)，對進一步研究牙周免疫系統(tǒng)的結構與功能具有重要意義。同時還可嘗試通過開發(fā)相應的藥物來阻斷LPS與TLR2、TLR4的結合從而阻斷TLRs的信號傳導通路，減輕LPS誘發(fā)的炎性細胞因子的釋放，從而為牙周病的治療和預防提供新途徑。

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［8］Sun Y，Shu R，Zhang MZ.Toll－ like receptor 4 signaling plays a role in triggering periodontal infection［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2008，52(3):362 －369.