肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx m RNA檢測(cè)的臨床意義

趙文杰， 周洪興， 王蘇建， 吳建康， 王家平， 張 平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx m RNA檢測(cè)的臨床意義

趙文杰， 周洪興， 王蘇建， 吳建康， 王家平， 張 平

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

目的 檢測(cè)肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞肺特異性X基因(Lunx)mRNA，探討兩者對(duì)肺癌輔助診斷的臨床意義。方法 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)肺癌患者、肺良性疾病患者、肺外腫瘤患者及健康人血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA。結(jié)果 肺癌組患者血漿Lunx mRNA陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=113．10，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=125．34，P ＜0．01)和健康組(χ2=100．33，P ＜0．01);Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者血漿Lunx mRNA陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=7．07，P＜0．05)。肺癌組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=32．79，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=44．44，P ＜0．01)和健康組(χ2=44．44，P＜0．01);Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=24．52，P＜0．01)。血漿Lunx mRNA檢測(cè)對(duì)肺癌輔助診斷的敏感性高于單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)的敏感性(χ2=36．46，P＜0．01)，血漿檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值高于外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值(χ2=16．37，P＜0．01)。結(jié)論 血漿與外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA檢測(cè)均可用于肺癌的輔助診斷，前者敏感性較后者高。

肺特異性X基因;循環(huán)RNA;循環(huán)腫瘤細(xì)胞;聚合酶鏈反應(yīng);肺癌

肺癌是呼吸道常見惡性腫瘤，由于肺癌早期癥狀不明顯，一旦確診大部分已屬中晚期，早期診斷、早期治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵［1］。在常規(guī)健康體檢中，與肺癌相關(guān)檢查一般僅有胸部X光片及一些比較成熟的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細(xì)胞角蛋白片段CYFRA-211、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等。早期肺癌腫塊較小且由于存在體位等因素的影響，X線檢查常無法顯現(xiàn)腫塊［2］。而上述腫瘤標(biāo)志物敏感性有限且對(duì)于肺癌均不特異。尋找一種取材較易且有較高敏感性與特異性的肺癌標(biāo)志物用于輔助診斷具有十分重要的意義。

有研究表明在腫瘤組織生長過程中既有腫瘤細(xì)胞亦有游離核酸進(jìn)入外周血［3-5］，因此檢測(cè)血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中肺癌特異基因的表達(dá)將是一種對(duì)肺癌進(jìn)行輔助診斷的新思路。肺特異性X基因(lung-specific X，Lunx)是 Iwao 等［6］采用mRNA差異顯示技術(shù)篩選克隆的一個(gè)人類肺組織特異性基因，在肺以外其他腫瘤組織中不表達(dá)或表達(dá)極少［7］。檢測(cè)肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Lunx mRNA對(duì)肺癌可能有重要的輔助診斷價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選取2008年12月至2011年1月來常州市第二人民醫(yī)院呼吸科就診，并被確診為原發(fā)性肺癌的患者108例，男65例，女43例，年齡31～87歲，平均63．1歲。所有患者住院期間均經(jīng)病理切片檢查并依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)所提出的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(2009版)將患者分為Ⅰ～Ⅳ期。其中Ⅰ期19例(包括 T1N0M07例、T2aN0M012例)，Ⅱ期40例(包括 T1N1M06例、T2bN0M011例、T2aN1M013例、T2bN1M010例)，Ⅲ ～Ⅳ期49例(包括 T2N2M04例、T3N1M014例、T3N2M012例、T4N2M011例、T3N3M05例、T2N2M1a2例、T3N3M1a1例)。另選取同期來院治療的其他肺部疾病患者86例作為良性疾病組，包括大葉性肺炎33例、痰結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者12例、慢性支氣管炎41例，年齡21～89歲，平均59．4歲。選取肺以外其他惡性腫瘤患者100例作為特異性對(duì)照組，該組患者均為原發(fā)性，包括肝癌20例、胃癌30例、食管癌20例、結(jié)腸癌30例，年齡32～83歲，平均66．2歲。選取來常州市第二人民醫(yī)院體檢，血常規(guī)、肝腎功能、胸部X光片均正常者88名作為健康對(duì)照組，年齡41～68歲，平均年齡57．8歲。

二、試劑

全血細(xì)胞RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)、血漿RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)、去 RNA酶 DNA消化酶(RNase-Free DNase Set)購自凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司;TaKaRa PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量試劑盒、pMD18-T克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit)購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司;PCR引物及TaqMan探針由上海生工生物工程有限公司合成，序列為跨外顯子設(shè)計(jì)，見表1。

表1 Lunx與β-actin的定量PCR擴(kuò)增引物及探針序列

三、RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

所有患者在未接受正規(guī)治療前均空腹采集靜脈血2．0 mL，健康對(duì)照組在前來體檢時(shí)采集靜脈血2．0 mL，所有血標(biāo)本均乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 h內(nèi)2 800×g離心15 min，吸取上層血漿800μL，按照血漿RNA提取試劑盒說明書提取血漿總RNA。剩余全血按全血細(xì)胞RNA說明書提取全血單個(gè)核細(xì)胞總RNA。提取的RNA按說明進(jìn)行DNA酶消化，去除殘存的DNA。隨即按RTPCR試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄部分的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)總體系為20μL，包括4μL 5 ×PrimeScript Buffer、4 μL Random 6 mers、1 μL oligo dT Primer、1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、5μL純化的RNA及5μLRNase Free雙蒸水。于37℃ 反應(yīng)15 min，然后于85℃滅活5 s，短暫離心后置－20℃ 保存。

四、熒光定量PCR

用試劑盒中定量PCR部分進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增儀為ABI 7000 PRISM熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL Premix Ex TaqTM溶液，正向與反向引物各1μL(終濃度為0．2μmol/L)，熒光探針溶液2 μL(終濃度為0．2 μmol/L)，ROX Reference Dye 1μL，cDNA模板5μL及滅菌蒸餾水15μL。按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s，擴(kuò)增45循環(huán)。為了消除RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄等標(biāo)本制備步驟各標(biāo)本間的效率差異，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。按照試劑盒說明書將擴(kuò)增后的產(chǎn)物T-A克隆至pMD-18載體質(zhì)粒中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選等步驟后提取質(zhì)粒DNA。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10∶1的比例依次梯度稀釋至1×108～1×102拷貝/mL，與標(biāo)本同步進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。分別對(duì)各標(biāo)本Lunx及內(nèi)參基因β-actin定量，以 Lunx與 β-actin 的定量比值“Lunx/β-actin”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 13．0軟件，以健康組為研究對(duì)象，分別確定本實(shí)驗(yàn)室血漿與外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx/β-actin的分布范圍，設(shè)分布范圍的上限為cut-off值，高于此值為陽性，不高于此值為陰性。陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4組人群血漿Lunx/β-actin分布

本研究所采用的熒光定量PCR方法擴(kuò)增Lunx與β-actin基因最低檢測(cè)限為103拷貝/mL。健康人血漿Lunx/β-actin分布范圍為0～0．26，取單側(cè)95%區(qū)間確定本實(shí)驗(yàn)室血漿Lunx/β-actin分布范圍為0～0．22，以其上限0．22為 cut-off值，肺癌組、肺良性疾病組、肺外腫瘤組、健康組陽性率分別為 75．93%、0．00%、0．00%、4．55%。肺癌組患者陽性率顯著高于肺良性疾病組(χ2=113．10，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=125．34，P ＜0．01)和健康組(χ2=100．33，P ＜0．01)，后 3 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿Lunx/β-actin陽性率分別為57．89%、67．50%、89．80%，Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=7．07，P ＜0．05)。見圖1。

圖1 4組人群血漿Lunx/β-actin分布

二、外周血中單個(gè)核細(xì)胞Lunx陽性率

肺癌組、肺良性疾病組、肺外腫瘤組及健康組外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx檢測(cè)陽性率分別為36．11%、2．33%、0．00%、0．00%。肺癌組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx陽性率高于肺良性疾病組(χ2=32．79，P ＜0．01)、肺外腫瘤組(χ2=44．44，P ＜0．01)和健康組(χ2=44．44，P ＜ 0．01)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ ～Ⅳ期肺癌患者陽性率分別為10．53%、17．50%和 61．22%，Ⅲ ～ Ⅳ期肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者(χ2=24．52，P ＜0．01)。

三、血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Lunx mRNA檢測(cè)對(duì)肺癌輔助診斷的價(jià)值

血漿中Lunx mRNA的表達(dá)對(duì)肺癌輔助診斷的敏感性高于外周血單個(gè)核細(xì)胞的敏感性(χ2=36．46，P ＜0．01)，陰性預(yù)測(cè)值高于外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值(χ2=16．37，P ＜0．01)。見表2。

表2 血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA檢測(cè)對(duì)肺癌輔助診斷的價(jià)值 (%)

討 論

Lunx基因定位于 20p11．1-q12，cDNA 全長1 015 bp，包含一個(gè)開放的讀碼框，編碼含257個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為 26．7×103［8-9］，是近年來發(fā)現(xiàn)的肺組織高度特異的基因。本研究采用熒光定量PCR檢測(cè)肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Lunx的表達(dá)，研究顯示肺癌組患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Lunx表達(dá)的陽性率均高于肺良性疾病組、肺外腫瘤組及健康對(duì)照組，提示兩者對(duì)肺癌均有一定的輔助診斷價(jià)值，并且血漿Lunx檢測(cè)對(duì)肺癌輔助診斷的敏感性顯著高于外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)的敏感性。以往的研究顯示臨床普遍采用的肺癌相關(guān)標(biāo)志物如CEA、CYFRA-211、NSE等雖然敏感性與本研究檢測(cè)血漿Lunx的敏感性相當(dāng)，但特異性卻低于本研究檢測(cè)的 Lunx mRNA［10-11］。

本研究顯示4組人群血漿中僅有一小部分PCR未擴(kuò)增出Lunx mRNA，包括健康人在內(nèi)的其他大部分人血漿中均有一定量的Lunx mRNA存在?？赡芤?yàn)長unx基因在正常肺組織中亦有少量表達(dá)，循環(huán)RNA的2個(gè)主要來源為凋亡和主動(dòng)分泌，在正常組織細(xì)胞中也同樣存在［4］，因此大部分人血漿中均有少量循環(huán)Lunx mRNA存在。本研究顯示多數(shù)健康人及非肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Lunx mRNA陽性率為0．00%，而肺癌患者由于腫瘤組織增生，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)脫落進(jìn)入外周血［3］，因此肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx有一定的陽性率。血漿中的陽性率較高可能是因?yàn)橛坞xRNA比單個(gè)細(xì)胞更易透過毛細(xì)血管壁進(jìn)入外周血［12］。晚期肺癌患者由于癌組織增大并向周圍浸潤，將會(huì)有更多的循環(huán)Lunx mRNA分子或肺癌細(xì)胞進(jìn)入外周血［13-14］，研究結(jié)果也證實(shí)Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞Lunx mRNA陽性率高于早期患者，兩者對(duì)肺癌的進(jìn)展性均有判斷價(jià)值。

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是輔助診斷惡性腫瘤的重要組成部分。用于常規(guī)篩查的理想標(biāo)志物除需取材容易、檢測(cè)方便外，還應(yīng)有一定的敏感性與特異性。RT-PCR檢測(cè)肺癌患者血漿Lunx mRNA，取材簡單，其敏感性和特異性好，能符合常規(guī)篩查的條件，可使肺癌的篩查效率有所提高。而對(duì)于外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)Lunx，雖然其對(duì)肺癌輔助診斷的敏感性沒有血漿高，但研究顯示是反映肺癌細(xì)胞血行微轉(zhuǎn)移的良好標(biāo)志物［6-7］。用患者外周血作為檢查材料，無論是血漿或是單個(gè)核細(xì)胞對(duì)肺癌的輔助診斷都有重要的意義。

［1］Mountain CF．Revisions in the international system for staging lung cancer［J］．Chest，1997，111(6):1710-1717．

［2］劉桂麗，秦立萍．肺癌X線檢查誤診173例原因分析［J］．臨床誤診誤治，2010，23(5):478-479．

［3］ 周晴接，楊建民．循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究進(jìn)展［J］．世界華人消化雜志，2010，18(11):1081-1087．

［4］Zhou H，Xu W，Qian H，etal．Circulating RNA as a novel tumor marker:an in vitro study of the origins and characteristics of extracellular RNA［J］．Cancer Lett，2008，259(1):50-60．

［5］XuW，Zhou H，Qian H，etal．Combination of circulating CXCR4 and Bmi-1 mRNA in plasma:a potential novel tumormarker for gastric cancer［J］．MolMed Report，2009，2(5):765-771．

［6］Iwao K，Watanabe T，F(xiàn)ujiwara Y，et al．Isolation of a novel human lung-specific gene，LUNX，a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non-small-cell lung cancer［J］．Int JCancer，2001，91(4):433-437．

［7］MitasM，Hoover L，SilvestriG，etal．Lunx is a superior molecularmarker for detection of non-small lung cell cancer in peripheral blood［J］．JMol Diagn，2003，5(4):237-242．

［8］謝 風(fēng)，李 輝，孫曉盈．RT-PCR法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者外周血Lunx mRNA的表達(dá)及臨床意義［J］．中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(7):905-907．

［9］莊 翔，劉倫旭，朱 文，等．肺癌患者外周血中Lunx mRNA的檢測(cè)及其臨床意義［J］．中國胸心血管外科臨床雜志，2007，14(3):184-187．

［10］ 萬錦平，黃建安，劉 皓，等．血清 SCC-Ag、CYFRA21-1、NSE、CEA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷價(jià)值［J］．臨床肺科雜志，2007，12(2):111-112．

［11］高 華，張炳昌，范衛(wèi)華，等．NSE、CYFRA21-1及CEA檢測(cè)在肺癌診斷中的價(jià)值［J］．山東醫(yī)藥，2010，50(27):11-12．

［12］EI-Hefnawy T，Raja S，Kelly L，et al．Characterization of amplifiable，circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics［J］．Clin Chem，2004，50(3):564-573．

［13］Swarup V，Rajeswari MR．Circulating(cell-free)nucleic acids-a promising，non-invasive tool for early detection of several human diseases［J］．FEBS Lett，2007，581(5):795-799．

［14］李 輝，劉鐵梅，孫景春，等．Lunx mRNA的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌外周血微轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究［J］．中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(4):487-489．

The clinical significance of Lunx m RNA detection in p lasma and peripheralmononuclear cells in patients w ith lung cancer

ZHAO Wenjie，ZHOU Hongxing，WANG Sujian，WU Jiankang，WANG Jiaping，ZHANG Ping．

(Department of Clinical Laboratory，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University， Jiangsu Changzhou 213003，China)

Objective To investigate the clinical auxiliary diagnosis significance of lung-specific X gene(Lunx)mRNA detection in plasma and peripheralmononuclear cells in patients with lung cancer．M ethods Lunx mRNA in plasma and peripheralmononuclear cells was detected by fluorescence quantitation polymerase chain reaction(PCR)in patients with lung cancer，benign lung disease，extrapulmonary tumor and healthy subjects．Resu lts The positive rate of Lunx mRNA from plasma in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group(χ2=113．10，P ＜ 0．01)，extrapulmonary tumor group(χ2=125．34，P ＜ 0．01)and healthy subjects(χ2=100．33，P ＜0．01)．The positive rate of Lunx mRNA in plasma in patients with Ⅲ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer(χ2=7．07，P ＜ 0．05)．The positive rate of Lunx mRNA in peripheralmononuclear cells in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group(χ2=32．79，P ＜0．01)，extrapulmonary tumor group(χ2=44．44，P ＜0．01)and healthy subjects(χ2=44．44，P ＜0．01)．The positive rate of Lunx mRNA in peripheral mononuclear cells in patients withⅢ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer(χ2=24．52，P ＜ 0．01)．For the auxiliary diagnosis of lung cancer，the sensitivity of Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells(χ2=36．46，P ＜0．01)．The negative predictive value of the Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells(χ2=16．37，P ＜ 0．01)．Conclusions The detection of Lunx mRNA in plasma and peripheral mononuclear cells can be used for the auxiliary diagnosis of lung cancer．The sensitivity in plasma is higher than that in mononuclear cells．

Lung-specific X gene;Circulating RNA;Circulating tumor cell;Polymerase chain reaction;Lung cancer

2011-11-25)

(本文編輯:范基農(nóng))

1673-8640(2012)08-0631-04

Q503

A

趙文杰，男，1971年生，主管技師，主要從事血液學(xué)檢驗(yàn)工作。

周洪興，聯(lián)系電話:0519-81087713。