標(biāo)本溶血對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫法結(jié)果的影響

陳海斌， 梁業(yè)賓， 黃慧嫦， 鄭幕陽， 蒙秀堅(jiān)

(1．廣西梧州市人民醫(yī)院，廣西梧州543000;2．廣西梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣西梧州 543000)

標(biāo)本溶血對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫法結(jié)果的影響

陳海斌1， 梁業(yè)賓1， 黃慧嫦1， 鄭幕陽1， 蒙秀堅(jiān)2

(1．廣西梧州市人民醫(yī)院，廣西梧州543000;2．廣西梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣西梧州 543000)

目的 探討標(biāo)本不同程度溶血對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫法(ECLIA)測(cè)定結(jié)果的影響。方法 將血液標(biāo)本人為干預(yù)成不同程度的溶血標(biāo)本，使用ECLIA檢測(cè)各組標(biāo)本中的甲狀腺功能、腫瘤標(biāo)志物、內(nèi)分泌激素等共28項(xiàng)指標(biāo)的濃度并做分析。結(jié)果 標(biāo)本溶血可使胰島素(INS)濃度降低，使葉酸(FA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)濃度升高，重度溶血有使鐵蛋白測(cè)定結(jié)果偏高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)測(cè)定結(jié)果不受溶血的影響。結(jié)論 除某些項(xiàng)目外大部分溶血標(biāo)本的ECLIA測(cè)定結(jié)果沒有受到影響。測(cè)定INS、FA、NSE時(shí)應(yīng)絕對(duì)避免使用溶血標(biāo)本，以確保結(jié)果準(zhǔn)確。

溶血;胰島素;葉酸;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;鐵蛋白;電化學(xué)發(fā)光免疫法

在日常檢驗(yàn)工作中，會(huì)經(jīng)常遇到各種原因?qū)е碌牟煌潭热苎臉?biāo)本。標(biāo)本溶血在質(zhì)量控制分析前期出現(xiàn)差錯(cuò)的6種影響因素中占第2位，占總差錯(cuò)率的26．7%［1］。標(biāo)本溶血干擾或影響臨床生化、血液常規(guī)、凝血功能的測(cè)定已有廣泛的報(bào)道和綜述。電化學(xué)發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是一種新近發(fā)展起來的具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速及無放射危害的分析技術(shù)。目前國內(nèi)除對(duì)標(biāo)本溶血影響這種分析技術(shù)測(cè)定個(gè)別項(xiàng)目如胰島素(INS)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)結(jié)果有研究外，對(duì)其他項(xiàng)目的研究尚未見報(bào)道。為了明確溶血對(duì)使用ECLIA測(cè)定的項(xiàng)目有何種影響，我們對(duì)血液標(biāo)本實(shí)驗(yàn)性人為干預(yù)成4種不同程度的溶血標(biāo)本，測(cè)定各組標(biāo)本中的腫瘤標(biāo)志物、內(nèi)分泌激素等共28項(xiàng)指標(biāo)的濃度并做分析。

材料和方法

一、儀器與試劑

采用Roche公司的E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒。

二、不同程度溶血標(biāo)本的制備

隨機(jī)抽取20份門診患者的靜脈血液，一針兩管，分別注入帶分離膠的促凝試管，其中一管37℃水浴30 min后3 000×g離心10 min，作為非溶血標(biāo)本。另一管放置－20℃冰箱保存2 h后取出融化，3 000×g離心10 min，分離溶血血清，用SYSMEX XT-1800i全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血紅蛋白(Hb)濃度，然后通過計(jì)算用相對(duì)應(yīng)患者的非溶血血清調(diào)整Hb含量為8、4、2、1 g/L的溶血標(biāo)本。測(cè)定人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)項(xiàng)目則選擇定性試驗(yàn)陽性的早孕患者，標(biāo)本處理方法相同。

三、測(cè)定項(xiàng)目

使用同一批次的試劑同時(shí)測(cè)定非溶血以及4種不同程度溶血標(biāo)本的促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、甲狀腺球蛋白(Tg);促黃體生成素(LH)、促卵泡生成激素(FSH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睪酮(TESTO);甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(FPSA)、β-HCG、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原15-3(CA15-3)、糖類抗原19-9(CA19-9)、非小細(xì)胞肺癌相關(guān)抗原21-1(CYFRA21-1)、糖類抗原 72-4(CA72-4)、NSE、鐵蛋白、C-肽(C-Peptid)、INS、葉酸(FA)、維生素 B12(Vit B12)共28個(gè)項(xiàng)目。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及評(píng)價(jià)方法

1．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS Ver12．0．1 for windows統(tǒng)計(jì)軟件分析，測(cè)定結(jié)果以ˉx±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，每一測(cè)定項(xiàng)目均經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．溶血干擾的評(píng)價(jià)方法 按以下公式評(píng)價(jià)溶血對(duì)測(cè)定的影響:|F|=(X－X0)/X0。式中:|F|為溶血引起的誤差;X為溶血血清待測(cè)物平均濃度;X0為非溶血血清待測(cè)物平均濃度。若|F|＞0．10，表示溶血干擾客觀存在;若|F|＜ 0．10，表示溶血干擾輕微，可以忽略不計(jì)。

結(jié) 果

溶血對(duì)28項(xiàng)指標(biāo)中4項(xiàng)指標(biāo)產(chǎn)生一定的干擾。其中標(biāo)本溶血可使 INS濃度降低(P＜0．05)，使FA、NSE濃度升高，且溶血程度越嚴(yán)重，變化越明顯(P ＜0．05、P ＜0．01);重度溶血有使鐵蛋白測(cè)定有使結(jié)果偏高的趨勢(shì)，但與非溶血組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。溶血對(duì)ECLIA測(cè)定其余24項(xiàng)指標(biāo)均無干擾。

表1溶血對(duì)ECLIA測(cè)定有干擾的項(xiàng)目分析(xˉ±s)

討 論

INS是一種肽類激素，主要由胰島B細(xì)胞分泌，其血清濃度測(cè)定對(duì)糖尿病分型具有重要意義。紅細(xì)胞中含有INS降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)［2-3］。IDE 是一種過氧化物水解酶，能夠高效、特異地降解INS，被認(rèn)為是在細(xì)胞水平降解INS最主要的酶。隨著紅細(xì)胞的破壞，其內(nèi)存的IDE釋放進(jìn)入血清，能導(dǎo)致溶血標(biāo)本INS濃度降低。本研究顯示，溶血標(biāo)本的溶血程度越嚴(yán)重，INS濃度越低。

NSE作為一種存在于正常人腦組織中的細(xì)胞內(nèi)酶，其血清或腦脊液中濃度異常升高是輔助診斷起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞或神經(jīng)元腫瘤(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤或小細(xì)胞肺癌)較為敏感和特異的指標(biāo)，其濃度監(jiān)測(cè)亦可作為評(píng)估治療效果的一種有效手段。NSE同樣也存在于紅細(xì)胞和血小板中［4］，溶血或離心不充分將會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果顯著升高;鄒自英等［5］的研究表明，溶血使血清中Hb濃度每增加1克，將導(dǎo)致NSE測(cè)定結(jié)果增加34．53 μg/L。

FA是一種水溶性B族維生素，F(xiàn)A對(duì)細(xì)胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用，是正常代謝、DNA合成和生成紅細(xì)胞必需的物質(zhì)。FA缺乏可引起巨幼細(xì)胞性貧血和白細(xì)胞減少，懷孕期間血清FA水平低下與胎兒神經(jīng)管缺陷有關(guān)。紅細(xì)胞中FA濃度約為血清的16．7倍，因此溶血會(huì)導(dǎo)致FA測(cè)定值明顯升高。

鐵蛋白是反映儲(chǔ)存鐵最敏感的指標(biāo)。鐵蛋白也是一種急性時(shí)相蛋白，在炎癥或腫瘤時(shí)會(huì)明顯增高，鐵蛋白廣泛分布在體液、組織和細(xì)胞中，在肝、脾、骨髓中含量最高，外周血包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和單核細(xì)胞都含有微量的鐵蛋白。其中紅細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白含量為0．25 fg/細(xì)胞;粒細(xì)胞為6．6 fg/細(xì)胞;淋巴細(xì)胞為 8．0 fg/細(xì)胞;單核細(xì)胞為54．6 fg/細(xì)胞［6］。由于標(biāo)本溶血釋放的 Hb也是一種含鐵蛋白，在使用免疫學(xué)方法定量鐵蛋白時(shí)可能與鐵蛋白抗體存在非特異性反應(yīng)，從而使測(cè)定結(jié)果偏高。本研究顯示，雖然溶血前、后鐵蛋白有增高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在溶血血清Hb＞8 g/L時(shí)使用 Sonntag［7］的評(píng)價(jià)方法提示溶血干擾客觀存在。

有研究表明，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)某些腫瘤標(biāo)志物如 CEA、AFP、β-HCG等項(xiàng)目時(shí)標(biāo)本溶血會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假性升高，其原因可能為紅細(xì)胞破壞釋放的亞鐵血紅素具有類似過氧化物酶的活性，其作用效應(yīng)與反應(yīng)體系中的標(biāo)記物辣根過氧化物酶(HRP)類似，會(huì)使加入的底物液［3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)］產(chǎn)生顯色反應(yīng)，造成假陽性或使結(jié)果偏高［8］。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，使用放射免疫方法(RIA)測(cè)定部分甲狀腺功能、腫瘤標(biāo)志物和性激素項(xiàng)目，輕、中度溶血對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，重度溶血由于稀釋效應(yīng)會(huì)使結(jié)果偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)［9－10］。雖然 RIA 具有較強(qiáng)的抗干擾能力，但存在同位素放射污染風(fēng)險(xiǎn)，在臨床上已逐漸趨于淘汰。

ECLIA系統(tǒng)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、無放射性危害及檢測(cè)快速等特點(diǎn)，其免疫反應(yīng)原理與放射免疫和酶免疫中的競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗體夾心法相似，但其某些特有技術(shù)可明顯降低或避免反應(yīng)體系中可能存在的非特異性干擾，如:(1)使用專利的生物素-鏈霉親和素包被技術(shù)，將以三聯(lián)吡啶釕為示蹤物質(zhì)的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合到直徑為2．8μm的磁珠載體上，這種結(jié)合體具有高度特異性和牢固性，并且鏈霉親和素不含糖基，這對(duì)檢測(cè)某些腫瘤相關(guān)糖基抗原不產(chǎn)生非特異性干擾;(2)通過磁性分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了結(jié)合相與游離相的完全分離，避免了交叉污染和細(xì)胞溶解后殘留物的干擾;(3)使用可精確控制的電位差而非通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能作為能量激發(fā)源，從而避免了某些細(xì)胞成分干擾氧化還原反應(yīng);(4)標(biāo)記物三聯(lián)吡啶釕在無電場(chǎng)和遞電子體(三丙胺)存在的自然環(huán)境下非常穩(wěn)定，因此用其標(biāo)記的抗原(抗體)試劑也非常穩(wěn)定。

綜上所述，雖然構(gòu)成血細(xì)胞的化學(xué)成分十分復(fù)雜，但只要血細(xì)胞內(nèi)不含待測(cè)物質(zhì)，或者溶血后血細(xì)胞破壞釋出成分不干擾反應(yīng)體系，理論上溶血對(duì)ECLIA測(cè)定結(jié)果沒有影響，除某些特定項(xiàng)目(INS、FA、NSE)外大部分溶血標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果仍然具有臨床意義。由于目前國內(nèi)使用ECLIA檢測(cè)的儀器和試劑均依賴國外進(jìn)口，成本較高，并且引起標(biāo)本溶血的因素和環(huán)節(jié)較多，在臨床上不可完全避免，重復(fù)檢驗(yàn)會(huì)增加患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此檢驗(yàn)師和臨床醫(yī)師了解溶血對(duì)ECLIA測(cè)定結(jié)果的影響或干擾是很有必要的。

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Influence of sample hemolysis on electrochem ilum inescence immunoassay results

CHEN Haibin1，LIANG

Yebin1，HUANG Huichang1，ZHENGMuyang1，MENG Xiujian2． (1．GuangxiWuzhou City People's Hospital，Guangxi Wuzhou 543000，China;2．GuangxiWuzhou Red Cross Hospital，GuangxiWuzhou 543000，China)

Objective To study the influence of different degrees of sample hemolysis on electrochemiluminescence immunoassay(ECLIA)results．M ethods The blood samples were manually intervened into different degrees of hemolysis，and were used for detecting and analyzing the concentrations of 28 indices such as thyroid function，tumor markers，endocrine hormones and so on in various groups of samples．Results Sample hemolysis can reduce the concentration of insulin(INS)，and the concentration of folic acid(FA)and neuron-specific enolase(NSE)were increased．Severe hemolysis can make the results to have a higher trend on determination of ferritin，however，itwas not statistically significant，and the determination results of other indiceswas notaffected by hemolysis．Conclusions The results ofmosthemolytic samples except certain indices are notaffected．The determinations of INS，F(xiàn)A and NSE should absolutely avoid hemolytic samples to ensure the accuracy of results．

Hemolysis;Insulin;Folic acid;Neuron-specific enolase;Ferritin;Electrochemiluminescence immunoassay

2011-10-25)

(本文編輯:龔曉霖)

梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(201102014)

陳海斌，男，1970年生，學(xué)士，主管技師，主要從事骨髓細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)工作。

1673-8640(2012)08-0651-03

R446．1

A