檳榔籽中抗氧化活性物質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)分析

韓 林，王兆丹，張海德，羅仕數(shù)

（1.重慶三峽學(xué)院生物系，重慶404100；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

檳榔籽中抗氧化活性物質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)分析

韓 林1，2，王兆丹1，張海德2，*，羅仕數(shù)2

（1.重慶三峽學(xué)院生物系，重慶404100；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

為了研究檳榔籽中的抗氧化活性物質(zhì)，通過(guò)柱色譜法分離純化檳榔籽乙醇提取物，結(jié)合抗氧化活性篩選，分離得到檳榔籽中主要的抗氧化活性物質(zhì)Fr-4。利用高效液相色譜分析其純度，經(jīng)波譜分析確定該物質(zhì)為表兒茶素。

檳榔籽，分離，抗氧化活性

檳榔 采摘自海南大學(xué)儋州校區(qū)植物園，海南品種，破殼取檳榔籽，干燥后備用，經(jīng)測(cè)定，檳榔籽粉末含水量為5.32%；ABTS 購(gòu)自Amersco公司；甲醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、無(wú)水乙醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；FW80微型高速試樣粉碎機(jī) 河北省黃驊市新興電器廠；CP225D型分析天平 德國(guó)Sartorius公司；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LABCONCO型真空冷凍干燥器 美國(guó)LABCONCO公司；Waters 2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；400MHz核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ABTS實(shí)驗(yàn)方法[3-4]取5.0mL 7mmol/L的ABTS溶液，加入88.0μL 140mmol/L的過(guò)硫酸鉀，在室溫下置于暗處反應(yīng)12~16h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。在734nm處，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇將ABTS自由基儲(chǔ)備液稀釋至吸光度為0.70±0.02，備用。準(zhǔn)確量取0.1mL不同濃度（50、100、150、200μg/mL）的樣品溶液，加入3.9mL ABTS+·溶液，混勻，在室溫下反應(yīng)6min，于734nm處測(cè)定吸光度（AE）。同時(shí)吸取3.9mL ABTS+·溶液，加入0.1mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液于734nm處測(cè)定吸光度（AB）。ABTS自由基清除率按下式計(jì)算：

1.2.2 檳榔籽乙醇提取物的制備與預(yù)處理 利用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液對(duì)檳榔籽粉末進(jìn)行提取，得到的檳榔籽乙醇提取物經(jīng)真空減壓濃縮后，分別利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶液進(jìn)行萃取。根據(jù)1.2.1中的方法對(duì)石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相進(jìn)行抗氧化活性對(duì)比，選擇抗氧化活性最強(qiáng)的相進(jìn)行分離純化。

1.2.3 硅膠柱層析實(shí)驗(yàn)與活性篩選[5-6]將待分離的樣品按一定比例（1∶20）溶解于氯仿中，加入一定量的硅膠，拌勻后，揮干溶劑，將吸附有樣品的硅膠輕輕均勻地添加在色譜柱的吸附劑上面。以甲醇-氯仿作為洗脫劑，按不同的比例（1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1）混合進(jìn)行梯度洗脫，得到五個(gè)部位，分別為Fr-1、Fr-2、Fr-3、Fr-4和Fr-5。以每瓶150mL收集洗脫液，真空濃縮后定容至相同體積，通過(guò)薄層層析進(jìn)行定性分析，同時(shí)根據(jù)1.2.1中的方法測(cè)定各部位的抗氧化活性。

1.2.4 高效液相色譜分析[7]將抗氧化活性最強(qiáng)的部位配制成一定的濃度，利用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：3.9×150mm；流動(dòng)相：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的冰醋酸水溶液和乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.5 核磁共振波譜分析[8]將抗氧化活性最強(qiáng)的部位溶解于氘代氯仿（CDCl3），利用400MHz核磁共振波譜儀，測(cè)定氫譜（1H-NRM）和碳譜（13C-NRM）。通過(guò)對(duì)譜圖的分析，結(jié)合參考文獻(xiàn)，確定該化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SAS9.0 for Windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯著性分析采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同相抗氧化活性對(duì)比

表1 不同相提取物對(duì)ABTS自由基清除能力Table 1 ABTS radical-scavenging activities of different phases

表2 不同部位對(duì)ABTS自由基清除能力（%）Table 2 ABTS radical-scavenging activities of different fractions（%）

不同相對(duì)ABTS自由基清除效果如表1所示，不同相對(duì)ABTS自由基均有一定的清除能力，且隨濃度的增加而增強(qiáng)。其中乙酸乙酯相的清除能力最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（50~200μg/mL）最大清除率為59.74%±0.76%。因此選擇乙酸乙酯相進(jìn)行下一步的分離純化研究。

2.2 不同部位抗氧化活性對(duì)比

各部位對(duì)ABTS自由基的清除作用如表2如示，F(xiàn)r-4和Fr-5對(duì)ABTS自由基的清除能力顯著強(qiáng)于Fr-1、Fr-2和Fr-3，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)（50~200μg/mL）最大清除率分別為97.70%±0.17%和95.64%±0.68%。通過(guò)TLC檢測(cè)（表3）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)r-4中只有一個(gè)斑點(diǎn)，而Fr-5中含有三個(gè)斑點(diǎn)，相比較而言，F(xiàn)r-4對(duì)ABTS自由基的清除能力更強(qiáng)，因此選擇Fr-4進(jìn)行高效液相色譜分析和核磁共振波譜分析。

表3 不同部位TLC檢測(cè)的顯色效果Table 3 The developing effect of different parts by TLC analysis

2.3 高效液相色譜分析

由圖1和表4可知，從乙酸乙酯相經(jīng)硅膠柱分離得到的Fr-4組分通過(guò)高效液相色譜分析，呈現(xiàn)三個(gè)吸收峰，其中保留時(shí)間為6.568min的吸收峰非常明顯，其純度為96.06%。因此可判斷Fr-4是一種從檳榔中分離得到的純度較高，抗氧化活性較強(qiáng)的化合物。

圖1 化合物Fr-4高效液相色譜圖Fig.1 Elution profile of Fr-4 by HPLC

表4 化合物Fr-4高效液相色譜圖譜分析Table 4 The analysis of Fr-4 by HPLC

2.4 核磁共振波譜分析

化合物Fr-4：白色針晶，易溶于氯仿，微溶于甲醇、乙醇，其N(xiāo)MR圖譜見(jiàn)圖2和圖3。

1H NMR（CD3Cl，400MHz）：δ6.85（1H，d，J=2.0Hz，H-2’），6.73（1H，d，J=8.1Hz，H-5’），6.70（1H，d，J=2.0Hz，H-6’），5.90（1H，d，J=2.3Hz，H-8），5.83（1H，d，J=2.3Hz，H-6），4.54（1H，d，J=7.5Hz，H-2），3.95（1H，m，H-3），2.81（1H，dd，J=16.1，5.0Hz，H-4a），2.48（1H，dd，J=16.1，8.1Hz，H-4b）。

13C NMR（CD3Cl，100MHz）：δ82.9（d，C-2），68.9（d，C-3），28.5（t，C-4），157.9（s，C-5），96.4（d，C-6），157.6（s，C-7），95.6（d，C-8），157.0（s，C-9），100.9（s，C-10），132.3（s，C-1’），116.2（d，C-2’），146.3（s，C-3’），146.3（s，C-4’），115.3（d，C-5’），120.1（d，C-6’）。

綜合以上數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[9]對(duì)照，鑒定化合物Fr-4為表兒茶素，結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖2 化合物Fr-4的1H-NRM圖譜Fig.2 1H-NRM spectra of compound Fr-4

圖3 化合物Fr-4的13C-NRM圖譜Fig.3 13C-NRM spectra of compound Fr-4

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)檳榔籽乙醇提取物的過(guò)柱分離，得到Fr-1~Fr-5五個(gè)組分，結(jié)合抗氧化活性篩選，確定其中Fr-4部位抗氧化活性相對(duì)較強(qiáng)。通過(guò)TLC檢測(cè)和HPLC分析可知，F(xiàn)r-4部位是一種純度較高的化合物。利用核磁共振波譜儀，測(cè)定氫譜（1H-NRM）和碳譜（13C-NRM）。通過(guò)對(duì)譜圖的分析，確定該化合物為表兒茶素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檳榔中主要的抗氧化活性物質(zhì)為表兒茶素。

圖4 表兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The chemical structure of Epicatechin

[1]Penpun Wetwitayaklung，Thawatchai Phaechamud，Chutima Limmatvapirat，et al.The study of antioxidant capacity in various parts of Areca catechu L[J].Naresuan University Journal，2006，14（1）：1-14.

[2]張興，梅文莉，曾艷波，等.檳榔果實(shí)的酚類(lèi)化學(xué)成分與抗菌活性的初步研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17（1）：74-76.

[3]Stéphanie Dudonné，Xavier vitrac，Philippe Coutière，et al. Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP，SOD and ORAC assays[J].J Agric Food Chem，2009，57：1768-1774.

[4]Fang ZX，Zhang YH，Yuan Lü，et al.Phenolic compounds and antioxidant capacities of bayberry juices[J].Food Chemistry，2009，113：884-888.

[5]D Grigonis，PR Venskutonis，B Sivik，et al.Comparison of different extraction techniques for isolation of antioxidants from sweet grass（Hierochloe odorata）[J].Journal of Supercritical Fluids，2005，33：223-233.

[6]徐靜，韋京豫，郭繼芬，等.石榴汁部分多酚類(lèi)物質(zhì)的分離鑒定[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10（1）：190-199.

[7]劉曉麗.余甘子多酚的分離、鑒定與生理活性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2007.

[8]呂海鵬.普洱茶的化學(xué)成分分析及其抗氧化活性研究[D].杭州：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，2005.

[9]崔艷君，劉屏，陳若蕓.雞血藤有效成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（2）：121-123.

Isolation and structural characterization of antioxidant activity compounds from betel nut seed

HAN Lin1，2，WANG Zhao-dan1，ZHANG Hai-de2，*，LUO Shi-shu2
（1.Department of Biology，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China；2.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to research the antioxidant activity compounds of the betel nut seed，the ethanol extract of betel nut seed was isolated and purified by column chromatography.Combined with antioxidant activity screening，F(xiàn)r-4 was isolated as the main antioxidant activity compounds of betel nut seed.HPLC was used to analyze its purity and epicatechin was identified by spectrum analysis.

betel nut seed；isolation；antioxidant activity

TS255.1

A

1002-0306（2012）03-0068-03

檳榔果別名仁頻、賓門(mén)、檳榔玉、榔玉等，是棕櫚科植物檳榔（Areca Catechu L.）的成熟種子，原產(chǎn)東南亞，在我國(guó)廣東、海南、云南、福建、臺(tái)灣等地均有栽培，尤以海南為多，是我國(guó)“四大南藥”之首。檳榔果的成分較為復(fù)雜，含有31.1%的酚類(lèi)，18.7%的多糖，14.0%的脂肪，10.8%的粗纖維，9.9%的水分，3.0%的灰分和0.5%的生物堿等物質(zhì)。Penpun[1]等曾對(duì)檳榔中各部位的抗氧化能力進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，檳榔籽甲醇提取物具有最強(qiáng)的抗氧化活性，多酚類(lèi)化合物是檳榔籽中主要的抗氧化物質(zhì)，而檳榔堿則沒(méi)有顯示出抗氧化活性。張興[2]等從檳榔果實(shí)的乙醇提取物中分離得到了5種酚類(lèi)成分，并確定了其結(jié)構(gòu)。然而，檳榔籽中主要的抗氧化活性物質(zhì)卻一直沒(méi)有確定。本研究通過(guò)柱色譜法分離純化檳榔籽提取物，同時(shí)進(jìn)行抗氧化活性篩選，利用核磁共振波譜分析確定檳榔籽中主要的抗氧化活性物質(zhì)及其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－02－11 *通訊聯(lián)系人

韓林（1985-），男，助教，研究方向：果蔬深加工與綜合利用。

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃（2007BAD76B03）；重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（201040）；重慶三峽學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)。