正交試驗(yàn)優(yōu)選玄參蒸制中試工藝的研究

曹 崗，季金玉，叢曉東*，張 云，蔡寶昌，3，4*

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江 杭州 310053；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210029；4.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，江蘇 南京 210061）

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，玄參主要分布于東北、華北與華東地區(qū)。玄參為咸寒之品，質(zhì)潤(rùn)多液，功能滋陰降火、解毒、利咽等，為臨床常用中藥。玄參主要含環(huán)烯醚萜苷類、苯丙素苷類、芳香糖苷類等，其中環(huán)烯迷萜苷類和苯丙素苷類成分的含有量都非常高［1］?！吨袊?guó)藥典》2010年版收載蒸透或潤(rùn)透，文獻(xiàn)報(bào)道，玄參炮制以直接蒸制的方法為好［2-3］，但目前采用的蒸制工藝缺乏客觀可控性較強(qiáng)的工藝參數(shù)，質(zhì)量難以得到完善系統(tǒng)的控制。玄參蒸制后，5-羥甲基糠醛 (5-HMF)的量較生品中明顯增加。研究表明，5-羥甲基糠醛具有多種生物活性［4-5］，對(duì)玄參炮制工藝及機(jī)制的研究具有重要意義，且尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

中試是在大規(guī)模產(chǎn)量前的較小規(guī)模試驗(yàn)。中試的目的是驗(yàn)證、復(fù)審和完善實(shí)驗(yàn)室工藝所研究確定的反應(yīng)條件，研究選定的飲片工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備結(jié)構(gòu)、材質(zhì)、安裝和車間布置等，為正式生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用蒸制法炮制玄參，以哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛和浸出物作為指標(biāo)，在中試規(guī)模上，運(yùn)用現(xiàn)代飲片工業(yè)設(shè)備，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選玄參最佳蒸制工藝參數(shù)，為更好地控制玄參炮制品質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器及試藥

Dionex UltiMate 3000型系列高效液相色譜儀(美國(guó) Dionex公司)；KQ—250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL—16C高速臺(tái)式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；AL204電子天平；XS105分析天平 (梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司)；蒸藥箱 (杭州春江自動(dòng)化研究所)；往復(fù)式切藥機(jī)。

乙腈、甲醇 (色譜純)、水 (重蒸水)，其他試劑均為分析純；哈巴俄苷對(duì)照品 (批號(hào)111730-200604)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，5-羥甲基糠醛對(duì)照品 (批號(hào) H40807—250MG)購(gòu)自 US ALDRICH chemistry。玄參藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張?jiān)浦魅沃兴帋熻b定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品中哈巴俄苷及5-羥甲基糠醛的測(cè)定［6］

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.03%磷酸水溶液 (A)-乙腈 (B)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，5-羥甲基糠醛及哈巴俄苷與其他峰達(dá)基線分離，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 玄參生品、制品及混標(biāo)色譜圖Fig.1 Chromatograms of crude，processed Scrophulariae Radix and mixed reference substances

2.1.2 對(duì)照品貯備液的制備 分別精密稱取哈巴俄苷對(duì)照品 0.204 mg和 5-羥甲基糠醛對(duì)照品0.340 mg置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取玄參樣品粉末約0.5 g，加入50 mL的50%甲醇，稱質(zhì)量，靜置1 h，超聲45 min，補(bǔ)足損失質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，離心即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液1.25、5、7.5、10、12.5、15 μL依次注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)求得回歸方程。5-羥甲基糠醛的回歸方程 Y=16688.6398X+0.3185385，r=0.9999；哈巴俄苷的回歸方程Y=24831.9316 X－0.0714074，r=1(n=6)；其結(jié)果表明5-羥甲基糠醛與哈巴俄苷分別在0.00425～0.05100 μg、0.00255～0.03060 μg進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取玄參供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定各組分的峰面積值(n=5)，計(jì)算得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為0.51%和1.19%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定各組分的峰面積值，計(jì)算得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為2.35%和1.85%(n=5)。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，平行制備5份，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的方法操作，進(jìn)樣10 μL，在上述色譜條件下分別測(cè)定，求得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的RSD分別為0.82%和2.84%(n=5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

2.2 炮制方法

2.2.1 生玄參的制備 取原藥材，去除多余根莖，洗凈，晾干，即得玄參樣品。

2.2.2 蒸制玄參的制備 取生玄參45 kg，平均分成9份，按照L9(34)正交表安排，置蒸藥機(jī)中蒸制，蒸透后稍晾，切薄片。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排 《中國(guó)藥典》2010年版收載的蒸制玄參，由于其中沒(méi)有具體可量化的操作工藝參數(shù)，給生產(chǎn)和質(zhì)量控制帶來(lái)不便，因此本試驗(yàn)選用智能化控制蒸藥機(jī)，采用正交設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)浸泡時(shí)間、蒸制時(shí)間、干燥溫度進(jìn)行優(yōu)選。參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以浸泡時(shí)間 (A)、蒸制時(shí)間 (B)和干燥溫度 (C)為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛的含有量及浸出物得率為指標(biāo)綜合進(jìn)行玄參蒸制工藝的考察。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

浸出物測(cè)定按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄中水浸出物測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定。將各樣品浸出物的量和總量最高的那一項(xiàng)值定為100分，把各號(hào)樣品的浸出物和含有量轉(zhuǎn)化為分?jǐn)?shù)。綜合加權(quán)評(píng)分，采用正交設(shè)計(jì)助手V3.1版計(jì)算機(jī)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal test

結(jié)果顯示:C因素有顯著性差異，故C因素確定為3水平，即干燥溫度95℃；A因素影響較小，由直觀分析為3水平，即泡30 min。B因素?zé)o顯著性差異，考慮到蒸制目的是便于切片，結(jié)合直觀分析確定為2水平，即蒸2 h。因此，最終確定最佳中試蒸制工藝為A3B2C3。

2.4 蒸制工藝驗(yàn)證 按照優(yōu)選出的玄參炮制工藝條件即浸泡30 min、蒸制2 h、干燥溫度95℃，分別制備3批樣品并測(cè)定各指標(biāo)成分。所制備的玄參飲片性狀好，測(cè)得樣品飲片整體性狀較好，所得樣品浸出物得率分別為 71.29%、71.32%、71.26%，5-羥甲基糠醛含有量分別為0.195%、0.197%、0.195%，哈巴俄苷的含有量分別為0.173%、0.169%、0.170%。見(jiàn)表4。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 3批玄參蒸制品中5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的測(cè)定Tab.4 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in three processed products of Scrophulariae Radix

2.5 玄參炮制前后5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物測(cè)定及比較 方法同前，結(jié)果見(jiàn)表5。玄參蒸制后哈巴俄苷與浸出物變化不明顯，但5-羥甲基糠醛的含有量劇增。

表5 玄參生品與蒸制品中5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的測(cè)定Tab.5 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in crude and processed products of Scrophulariae Radix

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在在進(jìn)行色譜分析時(shí)，采用了幾種流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定最佳流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了多種流動(dòng)相系統(tǒng):甲醇-水；乙腈-水；乙腈-0.1%甲酸；乙腈-0.3%磷酸進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，甲醇在較低波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)，梯度洗脫時(shí)基線漂移嚴(yán)重，而乙腈-水體系相對(duì)較好，另外在酸性條件下有較好的色譜峰分離，而故實(shí)驗(yàn)選取乙腈-0.3%磷酸為流動(dòng)相。結(jié)果表明酸性環(huán)境有利于各色譜峰的分離，但采用乙腈-0.1%甲酸時(shí)基線漂移且噪音明顯，故實(shí)驗(yàn)選取乙腈-0.3%磷酸為流動(dòng)相。

中藥指標(biāo)成分在炮制加工成飲片的過(guò)程中有所損失時(shí)不可避免的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化的蒸制工藝條件對(duì)玄參中主要成分哈巴俄苷的含有量影響很小。且玄參生品中5-羥甲基糠醛含有量很低，而蒸制品中含有量顯著增加。它主要是由己糖經(jīng)加熱分解產(chǎn)生，廣泛存在于含有糖類物質(zhì)的植物和食品中，一般在炮制或加熱后其含有量會(huì)增加。5-羥甲基糠醛是玄參炮制前后含有量變化極其顯著的物質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道這一被認(rèn)為有一定副作用的物質(zhì)具有增強(qiáng)大鼠紅細(xì)胞變形活性及抗氧化、改變血液流變學(xué)等對(duì)人體有益的作用，可能是一種曾被人們忽視的活性成分。前期研究表明它可以抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞改善血管微循環(huán)、保護(hù)肝細(xì)胞和促進(jìn)免疫系統(tǒng)功能，化學(xué)研究結(jié)合藥理研究可推測(cè)其可能是玄參炮制增效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

目前，中藥材炮制工藝大多缺乏科學(xué)合理的技術(shù)參數(shù)，且實(shí)驗(yàn)室研究的工藝參數(shù)放大至工業(yè)生產(chǎn)上就會(huì)有一定的偏差，因此實(shí)驗(yàn)室工藝無(wú)法直接應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，在中試規(guī)模上，采用自動(dòng)化蒸藥機(jī)研究玄參炮制品的工藝參數(shù)具有理論和實(shí)際應(yīng)用兩方面意義。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:108-109.

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［4］張發(fā)科，呂青濤，張兆旺，等.HPLC法研究不同工藝對(duì)玄參中哈巴俄苷和肉桂酸含量的影響［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2006，15(6):51-53.

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