溫度對(duì)黃連不同炮制品中生物堿的影響研究

沈曉慶，楊彥華，張 凡，降 雪，曲勝軍，賈天柱，2*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖。味苦，性寒。歸心、脾、胃、膽、大腸經(jīng)［1］。黃連的藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，能清熱燥濕，瀉火解毒，中醫(yī)常用于主治溫病熱甚心煩，濕熱痞滿，濕熱下痢等。黃連中成分主要為多種異喹啉生物堿，其中包括小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿、巴馬亭、藥根堿等［2］。黃連藥性寒涼，經(jīng)性熱的黃酒或性溫的姜汁、吳茱萸制后，能夠降低其苦寒之性，即以熱制寒，是為“反制”；經(jīng)苦寒的膽汁或鹽制后，則更增強(qiáng)了黃連的苦寒之性，使寒者益寒，是為“從制”［3］。一味黃連以寒熱不同的輔料炮制，即可發(fā)揮增寒和緩寒的雙重作用，這就是炮制的奧秘。有報(bào)道認(rèn)為生物堿為寒性藥的主要成分之一，由此可以推測(cè)，膽黃連寒性增強(qiáng)應(yīng)該與其中生物堿含有量增加有關(guān)［5］。在對(duì)黃連生品及膽汁黃連和酒黃連中主要生物堿類(lèi)成分及含有量的比較研究中，發(fā)現(xiàn)總生物堿含有量經(jīng)炮制后均有不同程度增加，酒黃連和膽黃連增加幅度接近，膽黃連各成分增加較酒黃連多［6］。但同時(shí)也有報(bào)道稱，在測(cè)定黃連8種不同炮制品生物堿含有量的研究中，發(fā)現(xiàn)黃連的生物堿以酒制＞醋制＞姜制＞萸制＞土制＞膽制＞鹽制＞碳制依次遞減，結(jié)果顯示膽黃連各成分較酒黃連少［7］。以上兩篇文獻(xiàn)的結(jié)論不一致，可能是由于黃連不同炮制品的炮制溫度、時(shí)間及輔料加入量不同等因素造成的。由此，本實(shí)驗(yàn)以酒黃連和膽黃連為黃連兩類(lèi)炮制品的代表，在不同溫度下進(jìn)行炮制，以更科學(xué)地考察黃連不同炮制品中生物堿含有量差異變化，為黃連不同炮制品的藥性研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC—10ATVP高效液相色譜儀 (日本島津公司)，SPD—10AVP紫外檢測(cè)器 (日本島津公司)，METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER)，KQ—250DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 磷酸、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、甲醇均為分析純。乙腈 (天津市大茂化學(xué)試劑廠)為色譜純。水為純凈水。

小檗堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0713-9906)，巴馬汀對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110732-200506)，鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿對(duì)照品由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院王智民教授惠贈(zèng)。黃連藥材購(gòu)自四川省藥材公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為為毛茛科植物黃連Coptis chinensis的干燥根莖。黃酒 (紹興市古泉釀酒廠，批號(hào)20100128，酒精度9%)，豬膽購(gòu)自市場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水 (45 ∶55)，內(nèi)含KH2PO43.4 g/L，SDS 1.7 g/L(再以磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；體積流量1 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)大于4000，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿與其他峰的分離度均大于1.5，峰形基本對(duì)稱。見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A)和60%膽汁潤(rùn)120℃烘干品 (B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Coptis chinensis Franch processed with 60%bile at 120℃(B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀、黃連堿、表小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇-鹽酸 (100∶1)溶解，制成質(zhì)量濃度分別為1.3150 mg/mL、0.9520 mg/mL、0.6360 mg/mL、0.6800 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液1.2 mL，鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液0.5 mL，鹽酸黃連堿對(duì)照品貯備液1.0 mL，鹽酸表小檗堿對(duì)照品貯備液0.7 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇-鹽酸 (100∶1)稀釋至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末各約0.1 g(過(guò)60目篩)，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸 (100∶1)的混合液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲 (250 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇-鹽酸 (100∶1)的混合液補(bǔ)失質(zhì)量，過(guò)濾，微孔濾膜 (0.22 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液得各供試品溶液。

2.4 線性范圍考察 精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸表小檗堿的回歸方程分別為:Y=2355830.78X－106694.99，r=0.9996；Y=3176270.75X －41517.90，r=0.9997；Y=2136177.61X －2389.44，r=0.9995；Y=2154179.15 X －27944.69，r=0.9996。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和鹽酸表小檗堿分別在0.1578～1.578 μg，0.0476 ～ 0.476 μg，0.0636 ～ 0.636 μg，0.0416～0.416 μg線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下操作，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿峰面積的RSD值分別為2.4%、2.1%、1.9%、1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液 (120℃膽汁潤(rùn)黃連)，室溫下放置，于0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)間間隔，分別進(jìn)樣分析，按2.1項(xiàng)下操作，測(cè)定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿峰面積的RSD值分別為1.3%、1.1%、1.9%、1.4%，結(jié)果表明供試品溶液于室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份(120℃膽汁潤(rùn)黃連)，按2.3項(xiàng)供試品溶液制備項(xiàng)下方法操作，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得各樣品中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿的RSD值分別為0.8%、1.1%、1.8%、2.3%，證明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知鹽酸小檗堿 (49.70 mg/g)、鹽酸巴馬汀 (8.23 mg/g)、鹽酸黃連堿(13.15 mg/g)和鹽酸表小檗堿 (7.00 mg/g)含有量的藥材 (生黃連)6份，每份約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸表小檗堿對(duì)照品貯備液0.50 mL(0.6800 mg/mL)、鹽酸黃連堿對(duì)照品貯備液1.00 mL(0.6360 mg/mL)、鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液0.30 mL(0.9520 mg/mL)、鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液2.00 mL(1.3150 mg/mL)于具塞錐形瓶中，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 炮制品的制備

2.9.1 直接烘干品 取凈生黃連片4份，每份20 g，分別在溫度為 120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放涼，備用。

2.9.2 60%膽汁潤(rùn)烘干品 取凈生黃連片4份，每份20 g，分別加入膽汁12 g，至密閉容器內(nèi)，拌勻，悶潤(rùn)6 h后，分別在溫度為120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放涼，備用。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.9.3 60%酒潤(rùn)烘干品 取凈生黃連片4份，每份20 g，分別加入黃酒12 g，至密閉容器內(nèi)，拌勻，悶潤(rùn)6 h后，分別在溫度為120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放涼，備用。

2.9.4 12.5%酒潤(rùn)烘干品 取凈生黃連片4份，每份20 g，分別加入黃酒2.5 g，至密閉容器內(nèi)，拌勻，悶潤(rùn)6 h后，分別在溫度為120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放涼，備用。

2.10 樣品的測(cè)定 取黃連各炮制品，按照供試品試液制備方法操作，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中各組分。結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

由表2到表5中數(shù)據(jù)可以看出，黃連不同炮制品的4種生物堿含有量隨著溫度的升高呈降低趨勢(shì)，且黃連直接烘干品下降幅度最大。其次為12.5%酒潤(rùn)烘干品。4種炮制品的表小檗堿和黃連堿含有量均隨著溫度的升高而降低。四個(gè)溫度下，4種炮制品中巴馬汀含有量差別不明顯。120℃時(shí)，生物堿總體上的含有量大致為12.5%酒潤(rùn)烘干品＞60%酒潤(rùn)烘干品＞直接烘干品＞膽汁潤(rùn)烘干品；140℃時(shí)，12.5%酒潤(rùn)烘干品＞直接烘干品＞60%酒潤(rùn)烘干品＞膽汁潤(rùn)烘干品；160℃時(shí)，60%酒潤(rùn)烘干品＞膽汁潤(rùn)烘干品＞12.5%酒潤(rùn)烘干品＞直接烘干品；180℃時(shí)，60%酒潤(rùn)烘干品＞膽汁潤(rùn)烘干品＞直接烘干品＞12.5%酒潤(rùn)烘干品。

表2 120℃不同炮制品4種生物堿Tab.2 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 120℃

表3 140℃不同炮制品4種生物堿Tab.3 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 140℃

表4 160℃不同炮制品4種生物堿Tab.4 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 160℃

表5 180℃不同炮制品4種生物堿Tab.5 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 180℃

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)參考了乙腈-0.1%磷酸溶液 (50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)［7］，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液 (28∶72)(磷酸調(diào)節(jié)pH 為3.0)［8］，乙腈-水 (45 ∶55，內(nèi)含磷酸二氫鉀0.34 g，十二烷基硫酸鈉0.17g)［3］，以及乙腈(A)-0.3%磷酸三乙胺 (B)進(jìn)行梯度洗脫［9］等色譜條件，并對(duì)其進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中分離度不好，故將流動(dòng)相做調(diào)整，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水 (45∶55)，內(nèi)含KH2PO43.4 g/L，SDS 1.7 g/L(再以磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)。該流動(dòng)相條件可將黃連中待測(cè)生物堿達(dá)到最好的分離效果。

3.2 前期考察膽黃連中膽汁的加入量時(shí)發(fā)現(xiàn)60%的綜合評(píng)分最高，所以本實(shí)驗(yàn)采用了60%的膽汁潤(rùn)烘干品。為了保證輔料量一致，黃連酒潤(rùn)烘干品也加入了60%的黃酒。本實(shí)驗(yàn)也額外考察了2010年版《中國(guó)藥典》［10］中酒黃連的炮制方法，即加入12.5%的黃酒。

3.3 在不同溫度下，60%酒潤(rùn)烘干品中生物堿的含有量大體上均高于膽汁潤(rùn)烘干品。結(jié)果顯示，加入相同量的黃酒與膽汁相比，生物堿的溶出率更高。

3.4 在同一溫度下，黃連4種炮制品中巴馬汀含有量差別不明顯，推測(cè)巴馬汀不為黃連中的寒性成分。

3.5 研究發(fā)現(xiàn)，在40 min烘制時(shí)間下，隨著溫度的升高，烘制品中部分鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)化成小檗紅堿，從而使小檗堿的含有量降低［11］。降雪等［12］發(fā)現(xiàn)酒黃連在170℃時(shí)產(chǎn)生小檗紅堿這種新的成分。本研究小組也發(fā)現(xiàn)經(jīng)高溫烘制的巴馬汀分離出來(lái)的一種成分也可以在烘制后的黃連中檢測(cè)到。因此，隨著溫度的升高，黃連中的某些生物堿遇熱，結(jié)構(gòu)被破壞，生成新的化學(xué)成分，使得原來(lái)的生物堿含有量降低。

3.6 由以上數(shù)據(jù)可以看出，黃連炮制品中生物堿的含有量與輔料的加入量和炮制溫度有關(guān)。不能單純地只通過(guò)觀察在同一個(gè)溫度下炮制的膽黃連和酒黃連中生物堿的含有量而推斷生物堿量的多少與黃連的寒熱藥性有關(guān)。

3.7 不同炮制品中，黃連直接烘干品中生物堿下降幅度最大，推測(cè)輔料對(duì)黃連中生物堿有保護(hù)作用。12.5%酒潤(rùn)烘干品比60%酒潤(rùn)烘干品中生物堿下降幅度大，可能是輔料量增多，在加熱過(guò)程中可以吸收一部分熱量，從而避免溫度升高對(duì)黃連中生物堿的破壞。黃連直接烘干品和12.5%酒潤(rùn)烘干品隨著溫度的升高，因?yàn)檩o料量少，所以生物堿易被破壞，生成小檗紅堿等其他成分。而目前尚不明確這類(lèi)新生成成分與黃連寒熱的關(guān)系，有待進(jìn)一步的研究。

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