痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS和5-HT表達的影響

楊德功， 付秋菊， 黃厚才， 鐘榮玲， 朱婉華， 田耀洲

（1.江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046；3.南通良春風濕病醫(yī)院，江蘇 南通 226009）

痛寧膠囊是南通良春風濕病醫(yī)院用于治療偏頭痛的院內制劑，其組方為孟河醫(yī)派傳人、國醫(yī)大師朱良春教授經(jīng)驗名方，早在50年代即臨床應用，療效顯著，隨后于1963年發(fā)表于《中醫(yī)雜志》，但其治療偏頭痛的機制仍不清楚，為此我們通過復制硝酸甘油型偏頭痛動物模型，觀察了痛寧膠囊對偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS及5－HT表達的影響，探討痛寧膠囊治療偏頭痛的作用機制，為臨床應用痛寧膠囊提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD大鼠48只，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2008－0016，雌雄各半，體質量(283±23)g，隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物組、痛寧膠囊高、中、低劑量組，每組8只。

1.1.2 主要藥物與試劑 痛寧膠囊，南通良春風濕病醫(yī)院院內制劑，批準文號:蘇藥制字 Z04 001376；產(chǎn)品批號: 091208；硝酸甘油注射液，每1 mL含硝酸甘油5 mg，由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準文號:國藥準字H11020289，生產(chǎn)批號:20 100911；琥珀酸舒馬普坦片，由天津華津制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號:國藥準字 H20040700，生產(chǎn)批號:006909T，用蒸餾水配制成質量濃度為1 mg/mL的藥液備用；兔抗 5－羥色胺抗體(Anti－5－HT)，貨號 bs－1126R；兔抗一氧化氮合成酶－1 抗體(神經(jīng)型)(Anti－NOS－1)，貨號 bs－0156R，均購自北京博奧森生物技術有限公司；SABC免疫組化檢測試劑盒，購自福建邁新生物技術開發(fā)公司；DAB購自美國Sigma公司；PBS緩沖液:南京醫(yī)科大學實驗室配制，每升中 含 8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH調至7.4；其它試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 偏頭痛模型建立及藥物干預 根據(jù)Tassorelli C等［1］報道的方法，除空白對照組不作處理，其余各組動物予以大鼠皮下注射硝酸甘油10 mL/kg，制作偏頭痛模型；30 min后按組灌胃給藥?？瞻讓φ战M和模型對照組灌胃等容積的蒸餾水，陽性藥物對照組灌胃琥珀酸舒馬普坦藥液6 mL/kg，痛寧膠囊藥液高、中、低劑量組分別以 8.64、4.32、2.16 g/kg藥液灌胃。

1.2.2 灌注、取材、切片 造模后4 h，立即用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉動物，仰臥固定，開胸，主動脈插管，剪開右心耳。首先迅速灌注無菌生理鹽水200 mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液150 mL，灌注后取大鼠腦組織，在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。制備下丘腦、腦干石蠟切片。

1.2.3 免疫組化SABC法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；PBS洗2遍，每遍5 min；切片浸入3%H2O2水溶液中，室溫封閉10 min，以去除內源性過氧化物酶；PBS洗3遍，每遍5 min；抗原微波修復20 min；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體；滴加一抗，4℃過夜；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min；PBS洗3遍，每遍5 min；滴加0.05%DAB+0.01%H2O2，顯色5～15 min；顯微鏡下隨時觀察顯色反應，至陽性顯色較強而背景不顯色時，自來水洗，終止顯色反應；蘇木素襯染、透明，中性樹膠封片。

1.2.4 圖片分析 光鏡下細胞核呈棕黃色染色者為陽性細胞。用顯微鏡照相系統(tǒng)和數(shù)碼成像系統(tǒng)進行拍攝200倍圖片，用Image ProPlus5.0.2圖像分析軟件測定各組每張切片上陽性細胞的平均面積。

2 結果

大鼠下丘腦、腦干經(jīng)免疫組化SABC法染色后，光鏡下背景為淡黃色，NOS、5－HT陽性細胞均呈棕黃色或棕褐色，多散在分布(見圖1～16中紅色箭頭所示)。經(jīng)數(shù)碼成像系統(tǒng)和圖像分析軟件，得如下結果。

2.1 各組大鼠下丘腦、腦干NOS陽性細胞平均面積的比較 下丘腦:與空白對照組比較，模型對照組NOS陽性細胞平均面積顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、痛寧膠囊高劑量組、中劑量組NOS陽性細胞平均面積均有不同程度減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，而低劑量差異無統(tǒng)計學意義。高、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較，統(tǒng)計學無顯著性差異(P＞0.05)。腦干:與空白對照組比較，模型對照組NOS陽性細胞平均面積明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高劑量組NOS陽性細胞平均面積均有不同程度減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而中、低劑量組差異均無統(tǒng)計學意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能明顯減少NOS陽性細胞平均面積，二者比較統(tǒng)計學無顯著性差異(P＞0.05)。見表1，圖1～8。

表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達陽性細胞平均面積的影響()

表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達陽性細胞平均面積的影響()

注:與空白對照組比較，*P＜0.05；＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01；與陽性藥物對照組比較，▲P＞0.05。下同。

組別 動物/只劑量/(g·kg － 1)NOS平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —221.35±67.68 243.10±53.81模型對照 8 — 317.52±60.34＊＊ 354.29±80.96＊＊琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 236.67±34.05△△ 275.05±52.06△痛寧膠囊 8 8.64 232.06±34.44△△▲ 257.52±72.73△▲痛寧膠囊 8 4.32 249.39±43.06△▲ 264.997±88.60痛寧膠囊8 2.16 288.13±66.25 297.64±91.96

圖1 偏頭痛動物模型空白組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖2 偏頭痛動物模型模型組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖3 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖4 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦NOS陽性細胞(×200)

圖5 偏頭痛動物模型空白組腦干NOS陽性細胞 (×200)

圖6 偏頭痛動物模型模型組腦干NOS陽性細胞 (×200)

圖7 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干NOS陽性細胞(×200)

圖8 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干NOS陽性細胞(×200)

2.2 各組大鼠下丘腦、腦干5－HT陽性細胞平均面積的比較下丘腦:與空白對照組比較，模型對照組5－HT陽性細胞平均面積顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高、中劑量組5－HT陽性細胞平均面積均有不同程度增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，而低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。高劑量組、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較，統(tǒng)計學無顯著性差異(P＞0.05)。腦干:與空白對照組比較，模型對照組5－HT陽性細胞平均面積顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高劑量組5－HT陽性細胞平均面積均有不同程度增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而中、低劑量組差異均無統(tǒng)計學意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能顯著增加5－HT陽性細胞平均面積，二者比較統(tǒng)計學無顯著性差異(P＞0.05)。見表2，圖9～16。

表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達陽性細胞平均面積的影響 ()

表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達陽性細胞平均面積的影響 ()

組別 動物/只劑量/(g·kg － 1)5－HT 平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —442.62±90.87 378.31±99.00模型對照 8 — 221.24±50.42＊＊ 262.32±59.61*琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 343.55±56.54△△ 322.31±30.31△痛寧膠囊 8 8.64 381.24±36.15△△▲ 324.16±49.26△▲痛寧膠囊 8 4.32 312.03±85.65△▲ 299.83±54.91痛寧膠囊8 2.16 252.17±53.35 243.88±45.65

圖10 偏頭痛動物模型模型組下丘腦5-HT陽性細胞(×200)

圖11 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦5-HT陽性細胞 (×200)

圖12 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦5-HT陽性細胞 (×200)

圖13 偏頭痛動物模型空白組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖14 偏頭痛動物模型模型組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖15 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖16 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干5-HT陽性細胞(×200)

3 討論

許多實驗和臨床研究表明，NO在偏頭痛和其他血管性頭痛的產(chǎn)生機制中起著十分關鍵的作用［2］。其可通過擴張血管，引發(fā)神經(jīng)源性炎癥，激活傷害感覺神經(jīng)元的敏感性，介導機體內痛覺信號的傳導，從而放大其生物學作用，致使痛覺的發(fā)生［3］。而NOS是合成NO的關鍵酶，可催化左旋精氨酸(L－Arg)生成瓜氨酸的同時釋放出內源性NO，前者NOS活性的增高與痛敏狀態(tài)的維持有密切關系［4］，且NOS陽性神經(jīng)元可能通過單突觸或多突觸連接引起自主神經(jīng)核運動核激活，參與偏頭痛的伴發(fā)癥狀如惡心、嘔吐等［5］。而后者可能協(xié)同其它神經(jīng)遞質在疼痛刺激的中樞傳遞中起重要作用，不但可以激發(fā)偏頭痛，而且能夠維持偏頭痛狀態(tài)［6］。

實驗中，予以皮下注射硝酸甘油后，大鼠下丘腦、腦干部位NOS表達增強，說明硝酸甘油能夠誘發(fā)NOS表達，NO合成增加，而進一步參與組織的發(fā)生免疫應答和炎癥反應，而予以痛寧膠囊干預后能夠顯著降低其表達，表明痛寧膠囊能夠阻止由硝酸甘油誘發(fā)的NOS的反應，減少內源性NO的生成。

研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦中含有多種 5－HT 的受體的亞型［7－8］，而不同類型5－HT受體在痛覺生理和病理生理中有不同的作用，在偏頭痛的發(fā)病機制中更是復雜。5－HT2A受體激動能夠引起NO的生成增加，從而引起顱腦血管的擴張，致敏血管周圍疼痛感受器和三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)中樞傷害性感受神經(jīng)元，觸發(fā)頭痛［9］。5－HT1B/1D受體激動劑，如舒馬普坦、佐米曲坦等能夠選擇性作用于血管平滑肌，使擴張的顱內動脈(主要是硬腦膜動脈)收縮，通過減少血管活性肽如降鈣素基因相關肽(CGRP)在血管周圍間隙的釋放，能減輕神經(jīng)源性炎癥，且對腦干及上部頸髓的三叉神經(jīng)尾側核的傷害性痛覺傳遞有抑制作用，還能調整一氧化氮信號轉導通路以及鈉離子依賴性細胞代謝活動［10］。形態(tài)學研究證明5－HT1FmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)有較高分布，選擇性的 5－HT1F受體激動劑lasmiditan可抑制電刺激三叉神經(jīng)節(jié)誘導的硬腦膜血漿蛋白的外滲及三叉神經(jīng)尾側c－fos的表達［11］，并且能夠有效治療偏頭痛的急性發(fā)作［12］，提示對于偏頭痛急性發(fā)作，5－HT1F受體的激動是一種可能的新的治療原則［13］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠腦干、下丘腦5－HT表達水平下降，而予以痛寧膠囊進行干預后，5－HT的表達水平上調，這可能是痛寧膠囊激動下丘腦部位5－HT受體亞型，使得傷害性痛覺上行傳導抑制；并且刺激腦干的5－HT能神經(jīng)元，激活5－HT疼痛下行調控系統(tǒng)。

綜上所述，痛寧膠囊能夠通過降低NOS的表達、上調5－HT的水平，從而調整與疼痛相關的血管活性物質及神經(jīng)遞質的水平，改善血管舒縮功能障礙，這可能是其治療偏頭痛的作用機制之一。

［1］Tassorelli C，Joseph S A.Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat［J］.Brain Res，1995，682(1－2):167－181.

［2］Olescn J，Thomsen L L，Iversen H.Nitric oxide is a key molecule in migraine and other vascular headaches［J］.Trends Pharmaeol Sci，1994，15(5):149－153.

［3］趙永烈，王玉來，高 穎，等.一氧化氮在偏頭痛發(fā)病中的作用［J］.中國臨床康復，2006，10(7):138－139.

［4］閻雪彬，黃曉玲，黃 東.NMDA受體和NOS參與骨癌痛小鼠嗎啡耐受的形成［J］.中南大學學報:醫(yī)學版，2010，35(5):458－463.

［5］王賀波，王建華，郭宗成，等.L－NAME減少三叉神經(jīng)脊束核尾側段和上頸髓后角c－fos和nNOS的表達［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2008，16(4):425－427.

［6］Jansen－Olesen I， Zhou M， Zinck T， et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in trigeminal ganglion cells during culture［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2005，97(6):355－363.

［7］Hannon J，Hoyer D.Molecular biology of 5－HT receptors［J］.Behav Brain Res，2008，195(1):198－213.

［8］Filip M，Bader M.Overview on 5－HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system［J］.Pharmacol Rep，2009，61(5):761－777.

［9］Srikiatkhachorn A，Suwattanasophon C，Ruangpattanatawee U，et al.5－HT2Areceptor activation and nitric oxide synthesis:a possible mechanism determining migraine attacks［J］.Headache，2002，42(7):566－574.

［10］Tepper S J，Rapoport A M，Sheftell F D.Mechanisms of action of the 5－HT1B/1D，receptor agonists［J］.Arch Neurol，2002，59(7):1084－1088.

［11］Nelson D L，Phebus L A，Johnson K W，et al.Preclinical pharmacological profile of the selective 5－HT1Freceptor agonist lasmiditan［J］.Cephalalgia，2010，30(10):1159－1169.

［12］Ferrari M D，F(xiàn)?rkkil? M F，Reuter U，et al.Acute treatment of migraine with the selective 5－HT1Freceptor agonist lasmiditan－A randomised proof－of－concept trial［J］.Cephalalgia，2010，30(10):1170－1178.

［13］Olesen J.5－Hydroxyptryptamine 1F(5－HT1F)receptor agonism.A possible new treatment principle for acute migraine attacks［J］.Cephalalgia，2010，30(10):1157－1158.