多指標(biāo)優(yōu)選清肝消痤顆粒水提工藝研究

戴 薇

（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028）

清肝消痤顆粒［1，2］系江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由梔子、丹參、甘草等藥味組成，具有清肝利濕，化痰散結(jié)的功效。該方療效確切，為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以方中的梔子苷、丹參素、甘草酸銨的含量為指標(biāo)，采用多指標(biāo)評分法優(yōu)選清肝消痤顆粒的水提工藝，為制定該該制劑的合理提取工藝提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（Alliance 2695四元泵及自動進(jìn)樣系統(tǒng)，996二極管陣列檢測，Empower色譜工作站）；Millipore Milli-Q純水器；METTLER萬分之一及十萬分之一電子天平（瑞士）。

1.2 試藥

梔子、丹參等藥材均購自南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室鑒定均為2010年中國藥典一部收載品種。梔子苷、丹參素、甘草酸銨對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號依次為：0749-200007、110855-200203、10731-200205），供含量測定用；重蒸水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提工藝正交［3］試驗(yàn)優(yōu)選

2.1.1 浸泡條件優(yōu)選

按處方比例，稱取2副藥材，加10倍量水浸泡，每隔30min觀察一次，結(jié)果2h后所有藥材基本浸透，吸水量約2倍。因此藥材在煎煮之前先浸泡2h。

2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，對影響水提取工藝的主要因素：加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)按四因素三水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。各因素水平見表1。

表1 水提因素水平

2.1.3 正交試驗(yàn)樣品制備

按處方比例稱取梔子、丹參、甘草等藥材適量，分別按正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)安排進(jìn)行試驗(yàn)，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮定容至500mL。

2.1.4 含量測定

選擇2017年10月至2018年6月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院眼科檢查確診的NAION患者18例（18眼）作為NAION組。其中男8例，女10例。年齡38～78（60.5±10.6）歲，病程3.5～8.0（4.8±1.8）個(gè)月。

梔子苷［4-5］的含量測定如下所示：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-水（12：88）；流速：1.0mL／min；檢測波長：240nm；柱溫：30℃。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取梔子苷適量，加甲醇溶解制成每1mL含369.0μg的梔子苷對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取梔子苷對照品溶液0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得其回歸方程為：Y＝1958169X-168000，r＝0.9999。以上結(jié)果表明，在0.185～7.380μg／mL范圍內(nèi)，梔子苷峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

（4）精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液（55.35μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，峰面積的RSD 0.1%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液1mL置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計(jì)算含量，測定結(jié)果見表2。

圖1 樣品中的梔子苷色譜

丹參素的含量測定如下［6，7］：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-0.5%乙酸（3：97）；流速：1.0mL／min；檢測波長：279nm；柱溫：35℃。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取丹參素適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.796mg的丹參素對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取丹參素對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得其回歸方程為：Y＝4.75×105X-7.84×104，r＝0.9999。以上結(jié)果表明，在0.796～15.920μg／mL范圍內(nèi)，丹參素峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

（4）精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液（0.0998 mg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，峰面積的 RSD 0.6%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計(jì)算含量。測定結(jié)果見表2。

甘草酸銨［8，9］的含量測定：

（1）色譜條件：色譜柱：Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-0.5%乙酸（37：63）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：250nm；柱溫：35℃。供試品的高效液相色譜圖見圖1。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取甘草酸銨適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.542mg的甘草酸銨對照品溶液。

（3）線性范圍考察：精密吸取甘草酸銨對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得其回歸方程為：Y＝6.72×105X-2.52×104，r＝0.9999。以上結(jié)果表明，在0.542～10.84μg／mL范圍內(nèi)，甘草酸銨峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

（4）精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液（84.5 μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL，峰面積的RSD 1.0%（n＝5）。

（5）供試品的制備：精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，即得供試品液，注入高效液相色譜儀，見圖1，由峰面積計(jì)算含量。測定結(jié)果見表2。

2.2 結(jié)果

2.2.1 測定結(jié)果

將1～9號實(shí)驗(yàn)綜合評分進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表2。

表2 水提正交試驗(yàn)及結(jié)果

2.2.2 方差分析結(jié)果

將1～9號實(shí)驗(yàn)綜合評分進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 正交優(yōu)選結(jié)果

由表2可見，影響水煎煮效果的主要因素中，提取次數(shù)（C）對指標(biāo)成分的影響最大，加水量（A）次之，提取時(shí)間（B）影響最小。最優(yōu)水平組合為A3B3C3，即12倍量水煎煮3次，每次90min。由表3可見，提取次數(shù)（C）對指標(biāo)成分的提取有顯著影響，而加水量（A）、提取時(shí)間（B）無顯著影響。綜合表2、表3分析結(jié)果，本著節(jié)能增效的原則，確定煎煮工藝為：A2B2C3，即加10倍量水煎煮3次，每次60min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取梔子、丹參等藥材，分別按A3B3C3和A2B2C3優(yōu)選工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮定容至500mL。分別對指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表4可見，我們確定的提取工藝A2B2C3與正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A3B3C3對指標(biāo)成分的提取比較接近，而比正交試驗(yàn)中含量最高的一組試驗(yàn)略高，說明確定的工藝合理。

3 討論

處方中梔子苷、丹參素和甘草酸銨的水溶性較好，故考慮用水提法對藥材進(jìn)行提取，考察了加水量、煎煮時(shí)間和提取次數(shù)提取率的影響，其中提取次數(shù)的影響較為顯著，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)約成本和時(shí)間的原則，選擇10倍量水煎煮3次，每次60min的提取工藝。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對方中梔子苷、丹參素、甘草酸銨含量進(jìn)行測定，運(yùn)用多指標(biāo)綜合評分法對清肝消痤顆粒的水提方法進(jìn)行優(yōu)選，方中梔子為君藥，丹參和甘草為臣藥，根據(jù)三藥的主要成分在處方中的藥理作用確定其權(quán)重系數(shù)更有科學(xué)性和合理性，對工業(yè)生產(chǎn)可以起到積極的指導(dǎo)作用。

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