MMP-9及VEGF蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

王全懂 張蕾 楊聰穎

膠質(zhì)細(xì)胞瘤約占顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤的40% ～50%，其不可控制的生長、較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)特性致使腫瘤易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。細(xì)胞外基質(zhì)完整與否以及腫瘤組織的血管發(fā)生是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9 MMP-9)在細(xì)胞外基質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)在誘導(dǎo)血管發(fā)生中起關(guān)鍵作用。多項證據(jù)顯示二者在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)并與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)的法觀察MMP-9及VEGF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并探討其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本選自我院病理科63例膠質(zhì)瘤存檔蠟塊。術(shù)前未接受放療、化療。其中，星形細(xì)胞瘤46例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤13例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤3例，混合細(xì)胞瘤1例，男性33例，女性30例;年齡5～70歲，平均年齡43.3歲。術(shù)后病理分級:Ⅰ級10例，Ⅰ～Ⅱ級7例，Ⅱ級13例，Ⅱ～Ⅲ級9例，Ⅲ級8例，Ⅲ～Ⅳ級2例，Ⅳ級14例。所有的病例術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。為統(tǒng)計學(xué)方便，把Ⅰ級、Ⅰ～Ⅱ級、Ⅱ級歸類為高分化膠質(zhì)瘤，Ⅱ～Ⅲ級、Ⅲ級、Ⅳ級歸類為低分化膠質(zhì)瘤。

1.2 試劑與實驗方法 標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后，組織作5 μm連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)ABC法染色。兔抗人MMP-9及VEGF蛋白多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，二抗、三抗購自北京中山生物技術(shù)有限公司，染色過程如下:將瘤組織石蠟切片脫蠟入水，0.3%的甲醇-雙氧水中10 min;分別將瘤組織切片浸入兔抗人MMP及VEGF抗體(1∶500 Santa Cruze)溶液中封閉;隨后依次進(jìn)入生物素化IgG工作液(北京中山)和SABC三抗工作液(北京中山)，室溫下各孵育2 h;辣根過氧化物酶標(biāo)記的DAB將免疫產(chǎn)物顯為棕黃色;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在孵育過程中用PBS溶液代替一抗做空白對照。

1.3 染色結(jié)果判斷 用光學(xué)顯微鏡觀察并確定MMP-9及VEGF免疫陽性產(chǎn)物分布部位。每份標(biāo)本隨機(jī)取三張切片，每張切片隨機(jī)取三個高倍視野，計數(shù)每張切片MMP-9及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)目并觀察染色強(qiáng)度，以腫瘤細(xì)胞胞漿、細(xì)胞間質(zhì)及血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為MMP-9、VEGF表達(dá)陽性。A:陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為記陰性(-)，不論其染色深淺;陽性細(xì)胞數(shù)11% ～50%為2分;陽性細(xì)胞數(shù)為50% ～80%為3分;陽性細(xì)胞數(shù)80%以上為4分。B:染色強(qiáng)度呈弱染色(淺黃色)為1分，中等染色(棕黃色)為2分，強(qiáng)染色(黃褐色)為3分。A+B為總分，總分為3分者為弱陽性，4～5分者為中等陽性，6～7分者為強(qiáng)陽性。為統(tǒng)計學(xué)處理方便并將(-)、(+)歸為陰性處理，(++)、(+++)歸為陽性處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) MMP-9陽性表達(dá)48例，總的陽性率48/63=76.19%，胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)均可見MMP-9蛋白的陽性表達(dá)。其中高分化(惡性程度低)MMP-9表達(dá)呈弱陽性，陽性產(chǎn)物主要分布細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，陽性率為19/30例(占63.33%);低分化(惡性程度高)者33例，MMP-9表達(dá)呈強(qiáng)陽性，陽性產(chǎn)物在密集分布胞漿及細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)。陽性率29/33例(占87.87%)，兩者差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037)。(見圖1，表1)

表1 MMP-9在低分化組與高分化組表達(dá)陽性率的比較(例，%)

圖1 MMP-9在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)400

2.2 VEGF在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) VEGF陽性表達(dá)47例，總的陽性率47/63=74.76%，VEGF蛋白的陽性主要分布與膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。其中高分化(惡性程度低)VEGF表達(dá)呈弱陽性，陽性率為17/30例(占56.67%)，低分化(惡性程度高)者33例，VEGF表達(dá)呈強(qiáng)陽性，陽性率，30(占90.90%)，兩者差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。(見圖2，表2)

表2 VEGF在低分化組與高分化組表達(dá)陽性率的比較(例，%)

圖2 VEGF在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)400×

2.3 MMP-9與VEGF表達(dá)的相關(guān)性 63例中MMP-9與VEGF均陽性表達(dá)41例，MMP-9陽性的腫瘤組織VEGF也趨于陽性表達(dá)，相關(guān)性分析r's=0.3136 P＜0.05，提示MMP-9與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，研究顯示盡管手術(shù)結(jié)合放化療等相關(guān)治療手段的不斷提高，其中位生存期不超過12個月，侵襲性生長、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差為其主要臨床特征。近年來的研究顯示細(xì)胞外基質(zhì)降解及腫瘤血管發(fā)生是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

基質(zhì)金屬蛋白是一類Zn+依賴性內(nèi)肽酶，具有降解各種細(xì)胞外基質(zhì)的作用，其中MMP-9又稱凝膠酶B，是基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs家族成員之一，其在胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖及組織重塑等正常的生理過程中發(fā)揮重要作用。由于其高效降解Ⅳ、Ⅴ膠原纖維，故可通過破壞腫瘤組織周圍的物理屏障促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵潤及轉(zhuǎn)移［1，2］。多項研究顯示MMP-9在結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌及口腔癌等多種惡性實體瘤內(nèi)呈高表達(dá)，并證實與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)［3-7］。本研究顯示在不同級別膠質(zhì)瘤中MMP-9表達(dá)強(qiáng)度不同，在高分化膠質(zhì)瘤(惡性程度低)MMP-9表達(dá)呈弱陽性，主要分布于胞漿內(nèi)及細(xì)胞間質(zhì);低分化(惡性程度高)的瘤組織中MMP-9表達(dá)呈強(qiáng)陽性，陽性產(chǎn)物在瘤體內(nèi)密集分布，染色濃重;且MMP-9在低分化瘤體中陽性表達(dá)率顯著高于高分化瘤體。同樣Rao JS和Rooprai HK的研究顯示MMP-9表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織學(xué)分級密切相關(guān)［8，9］，這與本研究結(jié)果具有一致性，提示MMP-9表達(dá)與腫瘤組織的惡性表型相關(guān)。另有研究顯示MMP-9 mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，且在腦膠質(zhì)瘤的侵潤、轉(zhuǎn)移及血管再生方面發(fā)揮重要作用，干擾MMP-9表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、腫瘤生長、和血管生成［10，11］。細(xì)胞試驗顯示抑制MMP-9表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的連接與生長［12，13］，其機(jī)制可能通過(ERK):PKCα/NF-κB 信號通路完成［14，15］。上述多項研究結(jié)果提示MMP-9可能成為預(yù)測膠質(zhì)瘤惡性程及侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)探針。

腫瘤的浸潤生長及轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤組織血管的形成，腫瘤組織血管生成受多因素調(diào)控，有多種細(xì)胞因子及信號通路的參與，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子，血小板源性生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子等，其中VEGF在血管發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，其機(jī)制可能通過分子變構(gòu)及酶加工形成多種亞型，與細(xì)胞外基質(zhì)中的乙酰肝素及細(xì)胞表面蛋白結(jié)合，釋放血管源性因子，精確調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長及血管生成，并且可增加血管的通透性，從而為血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前抗VEGF及其受體已成為腫瘤治療的新的靶點和新策略。本研究顯示VEGF在膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，少量位于細(xì)胞間質(zhì)，在不同級別膠質(zhì)瘤中有不同程度的表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤的級別愈高其表達(dá)強(qiáng)度愈高，差異具有顯著性，同時在低級別膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率與高級別陽性表達(dá)率相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其表達(dá)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)。

在本研究中MMP-9陽性表達(dá)主要彌散存在于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿、細(xì)胞間質(zhì)內(nèi);VEGF蛋白表達(dá)于血管的內(nèi)皮細(xì)胞，未見到明顯的邊緣效應(yīng)，MMP-9及VEGF蛋白在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，并且腦膠質(zhì)瘤分級越高，分化越差，MMP-9及VEGF蛋白表達(dá)越強(qiáng)，提示MMP-9及VEGF蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。提示聯(lián)合檢測MMP-9及VEGF蛋白可作為判斷膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的客觀指標(biāo)，對膠質(zhì)瘤的預(yù)后判斷具有一定意義。

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