動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留膠體金免疫層析和LC-MS/MS檢測(cè)方法的比較

趙彥嶺 張寧 胡自然 陳寶明 萬宇平（河北省獸藥監(jiān)察所 石家莊 050051 河北省畜牧獸醫(yī)研究所 保定 河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ④北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

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動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留膠體金免疫層析和LC-MS/MS檢測(cè)方法的比較

趙彥嶺①張寧②胡自然③陳寶明①萬宇平④*（①河北省獸藥監(jiān)察所 石家莊 050051 ②河北省畜牧獸醫(yī)研究所 保定 ③河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ④北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

采用膠體金試紙卡法和LC-MS/MS法分別對(duì)豬肉、豬肝樣品進(jìn)行檢測(cè)，鑒定膠體金試紙卡法和LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果的符合率。結(jié)果表明：應(yīng)用膠體金試紙卡法檢測(cè)樣品中萊克多巴胺的最低檢測(cè)限為5.0μg/kg，LC-MS/MS檢測(cè)方法的檢測(cè)限為0.25μg/kg；2種方法的檢測(cè)結(jié)果一致。膠體金試紙卡法特異性較高，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，成本低，適用于動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留的定性篩查；LC-MS/MS靈敏度高，適合于陽性樣品的確證和精確定量。

萊克多巴胺 動(dòng)物組織 膠體金試紙卡 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)

萊克多巴胺(Ractopamine, RAC)，化學(xué)名稱為1-(4-羥基苯基)-2[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙氨基]-乙醇鹽酸鹽，與克倫特羅(瘦肉精)均為β2受體興奮劑，在臨床上普遍用于治療支氣管炎和哮喘病。近幾年的研究表明，RAC具有控制動(dòng)物營養(yǎng)代謝路徑、增強(qiáng)飼料轉(zhuǎn)化率等作用，因此被用作新型促生長(zhǎng)添加劑。但由于萊克多巴胺在豬等動(dòng)物的體內(nèi)具有殘留并可以通過生物鏈方式進(jìn)入人體，當(dāng)積累超過一定量時(shí)表現(xiàn)出毒副反應(yīng)，出現(xiàn)心動(dòng)過速、心律失常及肌肉疼痛等癥狀[1-3]。近年來，RAC被不法商販作為“瘦肉精”替代品應(yīng)用于豬養(yǎng)殖業(yè)中。我國農(nóng)業(yè)部2002年176號(hào)公告將RAC規(guī)定為違禁藥物。相應(yīng)地，對(duì)于萊克多巴胺的檢測(cè)技術(shù)的研究提出了更高的要求。簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的萊克多巴胺檢測(cè)技術(shù)也越來越受到食品企業(yè)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。目前動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留分析主要采用免疫分析法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7]等方法。膠體金免疫層析法作為一種現(xiàn)場(chǎng)快速篩選方法已受到廣泛重視。為考察目前RAC的快速檢測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室大型精密儀器檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)效果，本實(shí)驗(yàn)采用膠體金免疫層析法和LC-MS/MS法對(duì)動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)不同兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)，純度99%以上；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(美國Sigma公司)，β-葡萄糖醛苷酶含量≥85000units/ml，芳基硫酸酯酶含量≥7500units/ml；萊克多巴胺膠體金試紙卡(北京勤邦生物技術(shù)有限公司)；乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基醚、甲酸、氨水(北京化學(xué)試劑公司)，分析純；甲醇、乙腈(美國Sigma公司)，色譜純。

1.1.2 儀器 2000SBL電子天平(美國Setra公司)；微量移液器 單道20~200ml和100~1000ml、多道50~300ml(美國Thermo)；8010S勻漿機(jī)(上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司)；QL-90漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；HH-S8恒溫水浴鍋(常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠)；LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司)。

1.1.3 試驗(yàn)用豬肉和豬肝 樣品均為市購，取適量新鮮或冷凍的豬肉、豬肝樣品，結(jié)凍，試驗(yàn)所用豬肉和豬肝攪碎制成均質(zhì)物，前處理用。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)條件 （1）色譜條件：色譜柱為BEH C18 (100×2.1mm，1.7μm)，柱溫為30℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸和0.05%氨水溶液，B相：乙腈；流速0.4ml/min；進(jìn)樣量5μl。（2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓3KV；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度400℃；碰撞氣流速 0.15ml/min；錐孔氣流速50L/h；脫溶劑氣流速550L/h。

1.2.2 樣品前處理方法 （1）膠體金試紙卡法：稱取1.0g均質(zhì)過的豬肉或豬肝樣品于10ml離心管中，加入1ml 0.02mol/L pH為7.4的磷酸鹽緩沖液作為樣品提取液，渦動(dòng)1min。放入80℃水中水浴15min，取出冷卻至室溫，待檢。（2）LC-MS/MS法：樣品前處理方法參考《農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008 動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中的酶解、提取和凈化步驟進(jìn)行操作[8]。

1.2.3 測(cè)定方法 （1）膠體金試紙卡法：取陽性的豬肉和豬肝樣品分別進(jìn)行質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0μg/L萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的添加，判定膠體金試紙卡的檢測(cè)限，每個(gè)濃度作3個(gè)平行。檢測(cè)方法為用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔中，從液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5~10min判定結(jié)果。（2）LC-MS/MS法：取標(biāo)準(zhǔn)品用LC-MS/MS檢測(cè)條件進(jìn)行分析，檢測(cè)時(shí)間及流動(dòng)相梯度洗脫情況見表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.2.4 結(jié)果計(jì)算 （1）膠體金試紙卡：用試紙卡檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)樣品為陰性時(shí)，試紙卡的T線和C線都顯色，表示樣品中萊克多巴胺濃度低于檢測(cè)限；當(dāng)樣品為陽性時(shí)，T線不顯色，表示樣品中萊克多巴胺濃度高于檢測(cè)限；當(dāng)試紙卡為無效時(shí)，則C線不會(huì)出現(xiàn)。膠體金試紙卡檢測(cè)結(jié)果判定如圖1所示：（2）LC-MS/MS法：采用外標(biāo)法對(duì)樣品中萊克多巴胺殘留量進(jìn)行定量分析，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為軸，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(μg/L)為軸，分別測(cè)定質(zhì)量濃度為0.0、1.0、5.0和10.0μg/L的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品中峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的萊克多巴胺的質(zhì)量濃度，即為樣品中萊克多巴胺實(shí)際殘留量。標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=aC+b，求得a和b，則C=(A-b)/a，式中：A—標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中萊克多巴胺峰面積；C—標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中萊克多巴胺峰濃度。

圖1 膠體金試紙卡檢測(cè)結(jié)果判定示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線

取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/L的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50ml離心管中，按照規(guī)定步驟操作，經(jīng)LC-MS/MS分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。試驗(yàn)表明萊克多巴胺在0.5~20.0μg/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，當(dāng)以萊克多巴胺的峰面積比對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到萊克多巴胺線性方程為A=1301.4C+0.03，相關(guān)指數(shù)R2=0.998916。

圖2 萊克多巴胺LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限

2.2.1 膠體金試紙卡法 膠體金試紙卡的檢測(cè)限是通過對(duì)添加了多個(gè)水平濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的樣品檢測(cè)而確定的。對(duì)添加濃度為1.0、5.0和10.0μg/kg的50份豬肉樣品和50份豬肝樣品的測(cè)定結(jié)果見表2。由于膠體金試紙卡對(duì)豬肉和豬肝樣品在萊克多巴胺的添加濃度為1.0μg/kg時(shí)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，在添加濃度等于或高于5.0μg/kg時(shí)的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，可判斷膠體金試紙卡對(duì)豬肉和豬肝樣品的檢測(cè)限為5.0μg/kg。

表2 萊克多巴胺膠體金試紙卡檢測(cè)限判定結(jié)果(n=3) (μg/kg)

2.2.2 LC-MS/MS法 在空白豬肉和豬肝樣品中添加0.1、0.25、0.5、1.0μg/kg質(zhì)量濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行3次平行測(cè)定，最低檢測(cè)限按照信噪比為3:1計(jì)算，得到該方法檢測(cè)限為0.25μg/kg。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果的比較

分別抽取30份豬肉樣品和30份豬肝樣品，采用膠體金試紙卡與LC-MS/MS檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。檢測(cè)結(jié)果表示：LC-MS/MS法測(cè)定陰性結(jié)果用“ND”表示，陽性結(jié)果以實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表示。以5μg/kg檢測(cè)限為豬肉和豬肝樣品的陽性判定線，即萊克多巴胺在樣品中的含量低于5μg/kg判定為陰性，含量高于5μg/kg樣品判定為陽性。

通過表3可知，利用膠體金試紙卡和LC-MS/MS法共檢測(cè)出1份陽性豬肉樣品和1份陽性豬肝樣品，圖3為膠體金試紙卡測(cè)定的樣品結(jié)果判斷，其中圖3-a和3-b中的檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶，表示膠體金試紙卡對(duì)該豬肉樣品和豬肝樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；圖3-c和3-b中的質(zhì)控線(C)出現(xiàn)紅色條帶，而檢測(cè)線(T)的紅色條帶均消失，表示膠體金試紙卡對(duì)該豬肉樣品和豬肝樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽性。圖4~7為陽性樣品的LC-MS/MS測(cè)定的質(zhì)量色譜圖。圖4表示采用LC-MS/MS法檢測(cè)陰性豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖；圖5表示采用LC-MS/MS法檢測(cè)陰性豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖；圖6表示采用LC-MS/MS法檢測(cè)豬肉樣品中的萊克多巴胺含量為14.2μg/kg；圖7表示采用LC-MS/MS法檢測(cè)豬肝樣品中的萊克多巴胺含量為8.2μg/kg兩種方法測(cè)定的陽性樣品和陰性樣品的檢測(cè)結(jié)果基本一致，可得出膠體金試紙卡的假陽性率為0，假陰性率為0，該方法適用于動(dòng)物組織中萊克多巴胺殘留量的測(cè)定。

表3 膠體金試紙卡和LC-MS/MS對(duì)豬肉和豬肝樣品的檢測(cè)結(jié)果的比較(μg/kg)

圖3 膠體金試紙卡測(cè)定的豬肉、豬肝樣品結(jié)果判斷圖

圖4 陰性豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖

圖5 陰性豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖

圖6 22#豬肉樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖

圖7 18#豬肝樣品中萊克多巴胺含量的質(zhì)量色譜圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用膠體金試紙卡和LC-MS/MS法對(duì)動(dòng)物組織中的萊克多巴胺殘留量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)豬肉和豬肝樣品進(jìn)行1.0、5.0和10.0μg/kg濃度的添加，得到膠體金試紙卡法的檢測(cè)限為5μg/kg，對(duì)豬肉和豬肝樣品進(jìn)行0.1、0.25、0.5、1.0μg/kg濃度的添加，得到LC-MS/MS法檢測(cè)限為0.25μg/kg；通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致，和LC-MS/MS法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，得到膠體金試紙卡的假陽性率為0，假陰性率為0。

LC-MS/MS法檢測(cè)靈敏度高，準(zhǔn)確度高，但樣品的前處理方法復(fù)雜，儀器操作時(shí)間比較長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高；利用膠體金試紙卡法檢測(cè)，特異性較高，不需要復(fù)雜的樣品處理及大型的配套儀器，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)結(jié)果直觀，檢測(cè)成本低，但由于試紙卡的靈敏度會(huì)受到一定的限制，所以該方法特別適合在現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模樣品抽查中使用，用于定性初篩。LC-MS/MS靈敏度高，適合于陽性樣品的確證和精確定量。

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（2011–11–08）

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