多胺化殼聚糖微球固定化AS1.398中性蛋白酶

王紅艷， 朱建星

(沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142)

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的一群酶類(lèi)，固定化中性蛋白酶可應(yīng)用于啤酒澄清、各種蛋白水解液的制備等方面.構(gòu)建性能優(yōu)良的載體往往是酶固定化成功與否的關(guān)鍵.殼聚糖(Chitosan，CS)是地球上僅次于纖維素的第二大類(lèi)天然高分子材料，殼聚糖分子鏈上含有大量的氨基和羥基，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、無(wú)毒，以及可生物降解、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，易于制成膜、多孔微珠、凝膠、納米粒子等多種形態(tài).殼聚糖被選擇作為固定化載體，在固定化酶并保持其活性方面有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)［1-4］.在幾類(lèi)固定化方法中，以共價(jià)結(jié)合法制備的固定化酶性能最為穩(wěn)定，符合工業(yè)化要求.研究表明，增加載體的親水性、增加載體活性側(cè)基手臂分子的長(zhǎng)度甚至構(gòu)建所謂“柔性鏈”有利于提高固定化酶活性［2-6］.

為適應(yīng)酶法生產(chǎn)工藝的實(shí)際要求，本文先從微米級(jí)單分散殼聚糖微球樹(shù)脂出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化后與親水性多胺偶聯(lián)，制備多胺化殼聚糖微球載體，與未經(jīng)多胺修飾的殼聚糖微球相比較，考察該偶聯(lián)了親水多胺分子鏈的殼聚糖微球載體對(duì)AS1.398中性蛋白酶的固定化效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要藥品及儀器

殼聚糖，脫乙酰度86.9%，濟(jì)南海得貝海洋生物有限公司，CS微球，實(shí)驗(yàn)室自制;環(huán)氧氯丙烷，AR，沈陽(yáng)市新西試劑廠;四乙烯五胺，CP，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;AS1.398中性蛋白酶，北京東盛華強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，50 000 U/g.其他試劑均為分析純.

電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華JJ-1;恒溫振蕩器，常州國(guó)華SHA-B;掃描電鏡，JEOL JSM-6360LV;紫外分光光度計(jì)，尤尼柯UV2000.

1.2 多胺化殼聚糖微球的制備

按文獻(xiàn)［6］方法，略有改進(jìn):稱(chēng)取CS微球5 g于100 mL甲醇中，滴加25 mL苯甲醛，于恒溫振蕩器中60℃反應(yīng)16 h，抽濾洗滌后將微球(殼聚糖的苯甲醛Schiff堿)浸泡在適量氫氧化鈉溶液中、加入60 mL環(huán)氧氯丙烷，50℃恒溫振蕩反應(yīng)4 h，抽濾洗滌后將環(huán)氧化微球置于100 mL乙醇中，加入100 mL四乙烯五胺或聚乙烯亞胺、適量氫氧化鈉水溶液，55℃反應(yīng)6 h，抽濾，最后將胺化反應(yīng)產(chǎn)物加入0.25 mol/L的鹽酸中攪拌48 h脫醛，調(diào)pH值到弱堿性后用蒸餾水充分洗滌，干燥，得終產(chǎn)品多胺化殼聚糖微球.以酸堿滴定法測(cè)定微球的氨基含量.

1.3 中性蛋白酶的固定化

稱(chēng)取適量多胺化殼聚糖微球置于燒瓶中，按5～6倍氨基摩爾數(shù)的量加入戊二醛，于乙醇中60℃反應(yīng)2 h，然后用蒸餾水、pH=8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌，真空干燥，稱(chēng)取干燥產(chǎn)品0.3 g于50 mL的三角瓶中，加入1 mL質(zhì)量濃度為5 g/L的中性蛋白酶溶液(經(jīng)紗布過(guò)濾)和19 mL的Tris-HCl緩沖液，室溫下連續(xù)振蕩反應(yīng)20 h，固定化酶用緩沖液洗滌數(shù)次，備用.

1.4 酶的活力測(cè)定

在錐形瓶中依次加入1 mL酶液(或0.3 g固定化酶)，加入10 mL已40℃預(yù)熱5 min的酪蛋白溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，pH=7.5的Tris-HCl緩沖液配制)，40℃振蕩反應(yīng)10 min，然后加入10 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，振搖，過(guò)濾，用Folin試劑顯色法測(cè)定濾液中的酪氨酸含量，以每分鐘釋放1 μg的酪氨酸的酶量定義為一個(gè)活力單位(U).

固定化酶的活力回收率=(固定化酶總活力/加入的游離酶總活力)×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體的表面形貌

圖1所示為固定化載體微球的SEM照片.

圖1 固定化載體微球的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of immobilization support microspheres

從圖1可以看出，多胺化殼聚糖微球粒徑為60 ～200 μm，多數(shù)粒徑分布在 100 μm 左右，較為均一，表面較光滑，這有利于減少固定化酶催化反應(yīng)過(guò)程中的擴(kuò)散限制效應(yīng)的不利影響.

2.2 酶用量對(duì)固定化酶活力回收率的影響

考慮到節(jié)能，未選擇低溫或高于酶的最適作用溫度下進(jìn)行固定化.在室溫，pH=8.0的條件下以不同酶用量固定20 h，制備固定化酶，結(jié)果如圖2所示.

圖2 酶用量對(duì)固定化酶活力及活力回收率的影響Fig.2 Effect of amount of enzyme on activity and recovery of immobilized enzyme

由圖2可知，隨著游離酶投加量的增加(固定化時(shí)加入的游離酶質(zhì)量濃度增大)，固定化酶活力在不斷升高，游離酶質(zhì)量濃度1～5 g·L-1時(shí)固定化酶活力上升的速度快，給酶量大(游離酶質(zhì)量濃度大于5 g·L-1)時(shí)固定化酶活力增加趨緩.由圖2還可知，酶用量增加時(shí)，活力回收率由60%左右不斷下降.其原因之一是固定化體系中的酶分子達(dá)到一定濃度時(shí)，被固定在載體表面的酶分子數(shù)量趨于飽和，當(dāng)酶用量再增加時(shí)，被固定化的酶量并未增加或增加很少，表現(xiàn)為酶活力回收率下降.加入的游離酶濃度越大，固定化酶的活力回收率越低.另一方面，固定化反應(yīng)體系中的酶量多時(shí)，一部分酶分子被非定向固定化在載體表面，這些酶分子的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生改變甚至活性中心被遮蔽，造成這些酶分子的活力降低甚至失活(無(wú)效固定化)，從而使固定化酶的表觀活力未與被固定的酶蛋白量成比例增加，酶活力回收率亦下降.為兼顧固定化酶活力和酶活力回收率，選擇適中的酶溶液質(zhì)量濃度5 g·L-1，這樣可既保證有較高的固定化酶活力回收率(49%)，同時(shí)固定化酶活也較高(384 U·g-1).

2.3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響

投加的游離酶質(zhì)量濃度為5 g·L-1，在室溫，pH=8.0的條件下對(duì)中性蛋白酶分別固定化不同時(shí)間，測(cè)定固定化酶的活力回收率，結(jié)果如圖3所示.

圖3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of immobilization time on recovery of immobilized enzyme

由圖3可知:固定化時(shí)間少于20 h時(shí)，固定化酶的活力上升較快，于20～25 h固定化酶活力回收率趨于穩(wěn)定，達(dá)到50%，隨后下降.這是因?yàn)樵诠潭ɑ跏茧A段酶分子以較快速度與載體結(jié)合，表現(xiàn)為固定化酶活力迅速上升;隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，載體表面結(jié)合的酶分子越來(lái)越多而發(fā)生擁擠，導(dǎo)致部分酶分子的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生細(xì)微變化，甚至有一些酶分子的活性中心被遮蔽，影響了底物及產(chǎn)物的傳質(zhì)擴(kuò)散，使部分被固定的酶分子的活力下降，當(dāng)之后新固定上去的酶分子帶來(lái)的活力增加量與已被固定的酶分子的活力下降幅度相當(dāng)時(shí)，表現(xiàn)為固定化酶活力增加趨緩;當(dāng)固定化后期，載體表面結(jié)合的酶分子數(shù)量已經(jīng)趨于飽和，活力下降的酶分子數(shù)亦較多，體系中酶分子的穩(wěn)定性隨振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)也出現(xiàn)下降，從而使固定化酶的表觀活力下降.綜上，最適固定化時(shí)間可確定為20 h.

2.4 固定化pH值對(duì)固定化酶活力回收率的影響

投加的游離酶質(zhì)量濃度為5 g·L-1，于室溫下分別在不同pH值條件下對(duì)中性蛋白酶固定化20 h，測(cè)定固定化酶的活力回收率，結(jié)果哪圖4所示.從圖4可看出，該固定化過(guò)程的最適pH值為8.0.

圖4 固定化pH對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of pH value on recovery of immobilized enzyme

2.5 多胺化殼聚糖微球與殼聚糖微球固定化效果的比較

用殼聚糖微球和多胺化殼聚糖微球載體分別經(jīng)戊二醛活化后，分別以最優(yōu)條件對(duì)中性蛋白酶進(jìn)行固定，結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知，采用多胺化殼聚糖微球載體制備的固定化中性蛋白酶活力回收率達(dá)40%～50%，遠(yuǎn)高于采用未經(jīng)多胺修飾的殼聚糖微球固定化中性蛋白酶的活力回收率.

表1 多胺化殼聚糖微球與殼聚糖微球固定化中性蛋白酶的比較Table 1 Comparison of immobilized neutral proteinase on different supports

圖5所示為殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu).對(duì)比殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu)可知:殼聚糖微球經(jīng)多胺化修飾后的氨基含量大大提高，使之與戊二醛的活化連接位點(diǎn)數(shù)量大大增加，也即提高了酶裝載量;且由于酶分子與載體微球之間間隔有親水性多胺分子，不僅可減小底物分子向酶活性中心擴(kuò)散限制阻力，還可在反應(yīng)體系中賦予被固定的酶分子一定的自由度，有利于保持酶分子在游離狀態(tài)下的活性構(gòu)象，從而獲得較高的酶活.

圖5 殼聚糖和多胺化殼聚糖的結(jié)構(gòu)Fig.5 Configuration of Chitosan and polyamine Modified Chitosan

2.6 固定化酶的性能

2.6.1 熱穩(wěn)定性

將固定化酶及游離酶在70℃下保溫1 h之后，再在40℃下測(cè)酶活力，發(fā)現(xiàn)固定化酶活力仍有原活力的62%，而游離酶保溫后活力只有原活力的20%，因此固定化酶具有較好的熱穩(wěn)定性.

2.6.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將固定化酶在4℃下儲(chǔ)存30 d后，仍保留有原活力的78%，而游離酶在4℃下儲(chǔ)存5 d后，其活力只為初始酶活力的一半，由此可見(jiàn)，固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離酶.

2.6.3 操作穩(wěn)定性

固定化中性蛋白酶連續(xù)使用不同批次后的相對(duì)活力變化結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 固定化酶的連續(xù)使用穩(wěn)定性Table 2 Use stability of immobilized enzyme

由表2可見(jiàn)，固定化酶連續(xù)重復(fù)使用9批次后仍保留有原固定化酶活力的一半.

3 結(jié)論

從制備的單分散殼聚糖微球樹(shù)脂出發(fā)，經(jīng)氨基保護(hù)、C6羥基環(huán)氧化、多胺化、脫醛等步驟制備了微米級(jí)多胺化殼聚糖固定化載體，氨基含量提高2倍以上.該載體對(duì)中性蛋白酶固定化效果較好，最佳固定化條件為:游離酶投加的質(zhì)量濃度為5 g·L-1，25℃，pH=8的條件下固定中性蛋白酶20 h，固定化酶表觀活力最高達(dá)384 U/g，固定化酶活力回收率達(dá)49%，是采用未改性殼聚糖微球固定化的2.7倍.該固定化中性蛋白酶的穩(wěn)定性較好，熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶.

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