生物法合成AA-2G的菌種產酶條件及轉化方法研究

邵 雙， 丁 淼， 關麗杰

(沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽 110142)

L-抗壞血酸(即維生素C，VC)為水溶性維生素，其作為酸性藥劑、還原劑、抗氧化劑、漂白劑以及化學反應物、食品和飲料中的穩(wěn)定劑［1］被廣泛使用.臨床上主要用于防治壞血病和傳染病，促進創(chuàng)傷愈合，是作為輔助治療的保健藥品.在化妝品中可作為還原劑、紫外線吸收劑和黑色素形成抑制劑.但L-抗壞血酸還原性強，極不穩(wěn)定，極易被熱和氧化劑破壞，尤其是光、重金屬和熒光物質能促進其氧化［2］，使其在應用方面受到很大限制.因此，如何增強穩(wěn)定性是其應用時急需解決的首要問題.近期，人們致力于L-抗壞血酸的衍生物研究，試圖找出既具有L-抗壞血酸的作用，又具有高穩(wěn)定性的衍生物.2-氧-α-D-吡喃型葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是由日本林原生物化學研究所與岡山大學藥學系共同發(fā)現(xiàn)的，其具有更高的穩(wěn)定性及抗氧化性，同時更易于吸收和利用［3-6］.AA-2G的化學合成十分困難，而采用糖基轉移酶，如α-葡萄糖苷酶、環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶等［7］，可將糖及供體的D-吡喃型葡萄糖基部分轉移到L-抗壞血酸的2-碳位置的羥基基團上脫水生成AA-2G，該生物轉化法是生產AA-2G可行途徑.然而迄今，我國對大量生產AA-2G的技術尚不成熟，本文對提高AA-2G合成效率的方法進行探討.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌種為沈陽化工大學生物工程實驗室篩選并保藏的環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶產酶菌種SHⅢA，該菌種為反硝化利斯特氏菌.菌種培養(yǎng)基為:可溶性淀粉 20 g，蛋白胨 5 g，Mg2SO4·7H2O 0.1 g，K2HPO40.5 g，Na2CO32 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.平板培養(yǎng)基加瓊脂7 g/L.

1.2 實驗方法

1.2.1 環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶酶活測定

菌種發(fā)酵液以4 000 r/min離心20 min，取上清液即為粗酶.取10 μL稀釋10倍的酶液，加入0.2 mol/mL甘氨酸-NaOH-NaCl緩沖液(pH8.55)0.2 mL，再加入質量分數(shù)為0.2%的可溶性淀粉液0.2 mL，振蕩，于40℃水浴反應10 min，立即加入0.5 mL 0.5 mol/mL醋酸溶液終止反應，然后加入3 mL質量分數(shù)為0.005%的碘液顯色，同時以蒸餾水為空白，不加酶液為對照，于700 nm波長處測定吸光度(OD值).使吸光度下降10%的酶量定義為一個酶活單位.按以下公式計算:

式中a為對照組的吸光度，b為樣品的吸光度

1.2.2 AA-2G的合成方法

在預先放好質量分數(shù)為0.2%硫脲2 mL的試管中加入質量分數(shù)為2%的L-抗壞血酸溶 液10 mL、質量分數(shù)為4%的 α-環(huán)糊精10 mL、發(fā)酵上清液20 mL，調節(jié)pH為6，抽真空后將試管放入恒溫搖床中，在200 r/min、上蓋錫紙、45℃條件下反應20 h.反應結束后加入1 mmol/L的 CuSO4溶液0.2 mL，以除去未反應的殘余L-抗壞血酸，100℃滅酶2 min.

1.2.3 AA-2G含量測定

標準加入法.采用稀釋適當倍數(shù)的待測反應液配制L-抗壞血酸的系列梯度濃度溶液，以此為標準溶液，于700 nm波長處測定吸光度(OD值)，繪制標準曲線.

1.2.4 菌種產酶條件的優(yōu)化

菌種采用1.1中的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分別針對菌種培養(yǎng)的碳源、氮源、金屬離子、pH值、溫度、接種量、培養(yǎng)時間7個因素，設計單因子實驗，重復3次，培養(yǎng)后測定菌懸液中環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶酶活，探知最佳菌種產酶條件.碳源分別采用可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖，每種碳源均取20 g/L，替代1.1培養(yǎng)基中的可溶性淀粉.

氮源采用硫酸銨、氯化銨、酵母膏、蛋白胨、硝酸鉀、尿素，每種氮源的含氮量相當于5 g/L蛋白胨，替代1.1培養(yǎng)基中的蛋白胨.

在前述確定的最佳培養(yǎng)基中分別添加Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Na+、K+的硝酸鹽或硫酸鹽，濃度均為0.5 mmol/L，以考察金屬離子對產酶活性的影響.

在培養(yǎng)6～96 h范圍內，間隔6 h連續(xù)測定酶活，探知最佳菌種培養(yǎng)時間.

分別設置培養(yǎng)基的 pH 為 6、7、8、9、10、11、12、13，探知最佳 pH 值.

分別設置培養(yǎng)溫度為 20、25、30、35、40、45℃，探知最佳培養(yǎng)溫度.

分別設置接種量為6%、8%、10%、12%、15%、20%進行菌株發(fā)酵，測定酶活以確定最佳培養(yǎng)條件.

1.2.5 AA-2G的合成條件優(yōu)化

產酶菌種采用1.2.4確定的最佳條件進行培養(yǎng)，菌懸液離心上清液為環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶粗酶液，以L-抗壞血酸為底物合成AA-2G.設計單因子實驗，3次重復，考察反應溫度、糖基供體的種類、L-抗壞血酸的濃度、反應時間及底物與糖基供體的濃度比對AA-2G合成的影響.

反應溫度分別設置為 20、25、30、35、40、45℃，以確定最佳溫度.

糖基供體分別選用糊精、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉、β-環(huán)糊精、玉米淀粉，以確定底物.

VC質量分數(shù)分別設置為2%、6%、10%、14%、18%、22%、26%，以確定最佳質量分數(shù).

在確定VC最佳質量分數(shù)基礎上，采用最佳糖基供體，設置VC與糖基供體的質量比率分別為 1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.5、1∶2.

反應時間分別設置為 20、30、44、54、68 h.測定AA-2G的含量，探明AA-2G最佳合成條件.

2 結果與分析

2.1 菌種產酶條件的優(yōu)化

2.1.1 碳源對菌種產酶活性的影響

分別采用7種碳源培養(yǎng)菌種后測定酶活，結果繪于圖1.由圖1可知:麥芽糖為碳源時酶活最高，達513 U/mL，其次為果糖和蔗糖，采用葡萄糖時酶活僅為63 U/mL.故在后續(xù)實驗中均采用麥芽糖為碳源.

圖1 碳源種類對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.2 氮源對菌種產酶活性的影響

分別采用6種氮源進行菌種培養(yǎng)后測定酶活，結果繪于圖2.由圖2可知:蛋白胨為氮源時酶活最高，達1 200 U/mL，其次為硫酸銨和氯化銨，采用尿素時酶活僅為619 U/mL.故在后續(xù)實驗中均采用蛋白胨為氮源.

圖2 氮源對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.3 金屬離子對菌種產酶活性的影響

在培養(yǎng)基中分別添加9種金屬離子進行菌種培養(yǎng)后測定酶活，結果繪于圖3.

圖3 金屬離子對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.3 Effect of metallic ion on CGTase activity produced by the given bacteria

由圖3可知:添加 Cu2+時酶活最高，達1 083 U/mL，添加Mn2+和Co2+也可獲得較高酶活，添加K+時酶活僅為398 U/mL.若培養(yǎng)基中不添加金屬離子，則酶活更低，為267 U/mL.故在后續(xù)實驗中均添加Cu2+.

2.1.4 pH值對菌種產酶活性的影響

培養(yǎng)基pH在6～13變化時的酶活結果繪于圖4.結果顯示:酶活隨pH升高而增大，當pH值為10時酶活最高，隨后降低.故在后續(xù)實驗中pH均調整為10.

圖4 pH對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.5 培養(yǎng)溫度對菌種產酶活性的影響

培養(yǎng)溫度在20～45℃范圍內變化時的酶活結果繪于圖5.結果顯示:酶活隨溫度升高而增大，當溫度為35℃時酶活最高，隨后降低.故在后續(xù)實驗中培養(yǎng)溫度均為35℃.

圖5 溫度對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.6 接種量對菌種產酶活性的影響

由圖6可知:接種量對酶活的影響較大，當接種量為10%時，酶活最高.故后續(xù)實驗的接種量均為10%.

圖6 接種量對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.6 Effect of inoculation amount of bacteria on CGTase activity

2.1.7 培養(yǎng)時間對菌種產酶活性的影響

在6～96 h內連續(xù)測定酶活，結果繪于圖7.結果顯示:隨著培養(yǎng)時間延長，酶活逐漸增大，72 h時酶活最高，達1 080 U/mL，隨后逐漸降低.故在后續(xù)實驗中菌種的培養(yǎng)時間均為72 h.

圖7 培養(yǎng)時間對菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶活性的影響Fig.7 Effect of cultural time on CGTase activity produced by the given bacteria

采用上述最佳產酶條件，即麥芽糖為碳源，蛋白胨作為氮源，金屬離子為Cu2+，pH值為10，培養(yǎng)溫度為35℃，接種量為10%，培養(yǎng)微生物，進行驗證試驗.最高酶活可達1 130 U/mL.

2.2 AA-2G的合成條件優(yōu)化

采用2.1的最佳產酶條件培養(yǎng)菌種，獲得粗酶液，對生物轉化法合成AA-2G進行研究.

AA-2G含量的測定采用標準加入法.以AA-2G質量濃度為橫坐標，700 nm波長處的吸光度(OD值)為縱坐標，繪制標準曲線，其為不經過原點的直線，如圖8所示.

圖8 AA-2G含量標準曲線Fig.8 The standard curve of AA-2G content

2.2.1 糖基供體種類對AA-2G合成的影響

由表1可知:β-環(huán)糊精作為糖基供體時，AA-2G的產量最高，為3.68 g/L，其次為麥芽糖，羧甲基纖維素鈉的產量最低.在后續(xù)實驗中均以β-環(huán)糊精為糖基供體.

表1 糖基供體對AA-2G合成的影響Table 1 Effect of donors of glycosyl on AA-2G synthesis

2.2.2 VC質量分數(shù)對AA-2G合成的影響

以不同VC質量分數(shù)進行反應，當其為22%時，AA-2G的含量最高，為6.76 g/L，18%時產量也較高，而10%以下時，AA-2G產量均較低(見表2).在后續(xù)實驗中VC質量分數(shù)均采用22%.

表2 VC質量分數(shù)對AA-2G合成的影響Table 2 Effect of concentration of VC on AA-2G synthesis

2.2.3 反應溫度對AA-2G合成的影響

合成AA-2G時的反應溫度以20℃最為適宜，產量可高達7.93 g/L，25℃和30℃時稍有降低，當反應溫度達40℃及以上時，產量急劇降低(見表3).這是由于在微生物培養(yǎng)中，酶活最高時的溫度為35℃，高溫可能引起酶活下降，從而導致AA-2G的合成減緩.在后續(xù)實驗中反應溫度均為20℃.

表3 反應溫度對AA-2G合成的影響Table 3 Effect of reaction temperature on AA-2G synthesis

2.2.4 反應時間對AA-2G合成的影響

表4顯示:反應時間為30 h時，AA-2G的含量最高，為7.23 g/L，再延長反應時間，產量不僅沒有提高，反而明顯降低.研究表明:環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶具有催化AA-2G生物合成的作用，也有催化逆反應即AA-2G分解的雙向作用［8］，故反應時間過長，存在AA-2G逆反應發(fā)生的現(xiàn)象，引起產量降低.

表4 反應時間對AA-2G合成的影響Table 4 Effect of reaction time on AA-2G synthesis

2.2.5 VC與糖基供體質量比對AA-2G合成的影響

當VC的質量分數(shù)為22%時，VC與β-環(huán)糊精的質量比為1∶1.5時，AA-2G的含量最高，為8.60 g/L(表5).

表5 VC與β-環(huán)糊精質量比對AA-2G合成的影響Table 5 Effect of ratio of VC and β-cyclodextrin on AA-2G synthesis

3 結論與討論

(1)供試菌種產環(huán)麥芽糊精聚糖轉移酶的最佳條件為:麥芽糖為碳源，蛋白胨作為氮源，金屬離子為Cu2+，pH值為10，培養(yǎng)溫度為35℃，接種量為10%，酶活性可達1 130 U/mL.該酶活值較之其它研究偏低，可能是測定方法不同所致，在合成反應中證明該酶活能滿足生產需求.

(2)生物法合成AA-2G的最佳反應條件為:反應溫度20℃，VC質量分數(shù)為22%，β-環(huán)糊精作為糖基供體且其質量分數(shù)為33%，反應時間為30 h，AA-2G的產量可高達8.60 g/L.據(jù)曹新志(2008)的研究，獲得AA-2G的產量為95.36 mg/L［8］，而王鵬等(2008)為 410 mg/L［9］，黃敏等(2006)為 104.21 mg/L［10］，與本文測得的產量差異較大，這里不排除測定方法差異、生物異質性等因素所致，但更主要的是菌種的差異，還有轉化方法的不同，如實驗中發(fā)現(xiàn)，將傳統(tǒng)的水浴鍋改進為搖床中反應，使生產率大大提高，并使高濃度底物的投加成為可能.本文中的AA-2G產率具有非常大的應用價值，值得在此基礎上繼續(xù)研究.

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