雙核鎳配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O與DNA作用和細(xì)胞凋亡研究

武光磊， 湛 琳， 徐 進(jìn)， 高恩軍

(沈陽化工大學(xué)配位化學(xué)研究室沈陽市無機(jī)分子基材料化學(xué)(國際)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110142)

DNA是生物體中重要的一類生物大分子，對(duì)于生命遺傳密碼的翻譯、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制起著非常重要的作用.順鉑(cis-DDP)，奧沙利鉑、卡鉑等鉑配合物作為廣譜抗腫瘤藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，促使很多研究者研究了大量金屬配合物與DNA的反應(yīng)，探討金屬配合物與DNA作用的反應(yīng)機(jī)理，進(jìn)而研究金屬配合物的分子結(jié)構(gòu)及與DNA反應(yīng)機(jī)理的關(guān)系，為篩選出新的生物學(xué)研究工具，設(shè)計(jì)合成出具有應(yīng)用前景的低毒、高效、抗菌、抗腫瘤藥物提供一定的科學(xué)研究基礎(chǔ)及理論根據(jù)［1-5］.

1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸存在眾多配位原子，可分步失去質(zhì)子，表現(xiàn)出靈活多變的配位方式.配體本身具有較好的水溶性，其氮氧原子易分別與親氮和親氧離子配位，其2-位氮原子還可提供氫鍵作用或配位作用.此外，基于Htda有機(jī)分子配體配合物性質(zhì)的報(bào)道目前還很少，本文參照文獻(xiàn)［6］合成雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O.Barton 等人［7］提出［Ru(phen)3］2+與DNA作用時(shí)有插入和靜電作用2 種模式，Norden 等人［7］則認(rèn)為［Ru(phen)3］2+與DNA 作用時(shí)只存在靜電作用1種模式［1，6］.金屬配合物與DNA之間的作用機(jī)理與模式一直存在一定的爭議，針對(duì)此問題用紫外分光光度法、熒光分光光度法和凝膠電泳法對(duì)雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O與DNA之間的相互作用進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示此配合物主要以靜電作用與DNA結(jié)合，但也存在一定的插入作用.此外，對(duì)配合物引發(fā)細(xì)胞凋亡的能力與順鉑做比較，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡效果明顯區(qū)別于順鉑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

PXJ21C數(shù)字顯示離子計(jì)，配丹麥2401B型Ag/AgCl復(fù)合電極;Nicolet IR2470型紅外光譜儀，KBr壓片;Bruker CCD晶體衍射儀;UV-240島津近紅外可見紫外分光光度計(jì)，日本島津;PerkinElmer熒光分光光度計(jì)，美國鉑金埃爾默;培清凝膠成像分析系統(tǒng)，上海培清.

1.2 試劑

小牛胸腺DNA，國藥集團(tuán)產(chǎn)品;Hela細(xì)胞DNA，本實(shí)驗(yàn)室自己提取，相對(duì)分子質(zhì)量大于30 000，用前作進(jìn)一步稀釋處理，純度以260 nm處吸光度與280 nm處吸光度的比值檢測(cè)(A260/A280=1.9);其他試劑均為分析純.

1.3 配合物的合成

按文獻(xiàn)［7］方法合成雙核鎳(Ⅱ)金屬配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O，元素分析、單晶衍射和紅外吸收光譜與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致.

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

研究配合物與DNA的作用時(shí)，樣品均溶解在含5 mmol·L-1Tris(三羥甲基氨基甲烷)和50 mmol·L-1NaCl的二次蒸餾水緩沖液(pH=7.10)中，小牛胸腺DNA和Hela細(xì)胞DNA的濃度以ε260=6 600 L·mol-1·cm-1確定.

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的結(jié)構(gòu)

從圖1可看出，2個(gè)金屬Ni(Ⅱ)原子分別與4個(gè)氧原子(3個(gè)來自水分子，1個(gè)來自Htda配體)和2個(gè)氮原子(分別來自2個(gè)Htda配體)配位螯合成2個(gè)五元環(huán)和1個(gè)六元環(huán)的近平面穩(wěn)定結(jié)構(gòu).在配合物的單元分子中，存在4個(gè)游離水分子，為維系空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性氫鍵的形成提供基石.在Ni(1)和Ni(2)兩個(gè)鎳原子形成的配位鍵中，Ni(1)—N(3)和Ni(1)—N(5)的鍵長分別 為 0.206 67 nm 和 0.205 03 nm，Ni(2)—N(2)和 Ni(2)—N(4)的鍵長分別為0.202 95 nm和0.206 19 nm，N(5)—Ni(1)—N(3)和N(2)—Ni(2)—N(4)的鍵角分別為96.000°和96.477°，二者都存在略微的差異，同樣Ni(1)和Ni(2)與氧原子之間的配位也存在略微的差別，但整個(gè)配合物近乎是一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu).水分子的體積忽略，則可看做一個(gè)大五元環(huán)六元環(huán)交錯(cuò)的平面矩形.配合物的部分晶體數(shù)據(jù)如下:空間群:C2/c;F(000):2 504;衍射映像/獨(dú)特性:11 954/3 762［R(int)=0.029 2］;完整性，%:99.6;擬合度 F2:1.058;數(shù)據(jù)/限制/參數(shù):3 762/4/360;R最終指數(shù)(I＞2σ(I)):R1=0.317，wR2=0.074 9;R指數(shù)(所有數(shù)據(jù)):R1=0.039 9，wR2=0.080 4.

圖1 配合物單元結(jié)構(gòu)(氫原子被省略)Fig.1 Complexes with structural(H atoms are omitted)

2.2 紫外光譜法研究雙核鎳(Ⅱ)配合物與小牛胸腺DNA作用

紫外光譜法是很多種檢測(cè)配合物與DNA作用的方法之一［8］.含有堿基生色團(tuán)的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子，其UV/Vis吸收光譜在260 nm附近有一強(qiáng)吸收峰，當(dāng)小分子與核酸結(jié)合后，對(duì)核酸或小分子吸收峰的吸收光譜都會(huì)引起變化，可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對(duì)金屬配合物與作用模式進(jìn)行判斷.對(duì)于DNA的吸收光譜:如導(dǎo)致構(gòu)象變化，則產(chǎn)生減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，且作用越強(qiáng)減色效應(yīng)越明顯;如導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，則產(chǎn)生增色效應(yīng)［9］.對(duì)于金屬配合物等小分子的特征吸收譜帶，當(dāng)金屬配合物嵌插到DNA堿基對(duì)中，即發(fā)生插入作用時(shí)，將會(huì)發(fā)生減色效應(yīng)，這是因?yàn)镈NA堿基對(duì)與插入配體間發(fā)生π電子堆積，使后者的π*空軌道上也有一定的電子填充，從而使電子從金屬轉(zhuǎn)移到配體上躍遷(MLCT躍遷)的幾率減少.減色效應(yīng)的強(qiáng)弱，能夠反映插入能力的大小，插入能力越強(qiáng)，減色效應(yīng)越強(qiáng).與DNA發(fā)生插入作用后的配合物，插入配體與DNA堿基對(duì)間發(fā)生π電子堆積后，配合物的配體共軛性加強(qiáng)，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，紅移程度反映出插入能力的大小.插入能力強(qiáng)的配合物，紅移較大，插入能力弱的配合物，紅移較?。?0］.

配合物與小牛胸腺DNA作用的紫外光譜圖見圖2.配合物在波長為210～360 nm的紫外范圍內(nèi)有明顯的特征吸收峰，為芳香氮堿配體內(nèi)的n-π*電子躍遷形成，DNA的摻入使配合物各特征吸收峰在波長發(fā)生明顯的減色效應(yīng)，DNA濃度越大，趨勢(shì)越明顯，并有等色點(diǎn)生成.說明配合物與DNA之間建立了新的平衡關(guān)系，生成新的化合物物種.配合物以靜電方式與DNA螺旋堿基對(duì)結(jié)合，發(fā)生孤對(duì)電子靜電吸引作用，配體上孤對(duì)電子數(shù)目減少，使n-π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng).

圖2 配合物與DNA作用的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of complex with DNA

2.3 熒光光譜法研究雙核鎳(Ⅱ)配合物與小牛胸腺DNA的作用

溴化乙錠(EB)具有共軛芳香環(huán)的平面結(jié)構(gòu)，能專一平行地嵌入DNA雙鏈的配對(duì)堿基之間.在水溶液中，其本身熒光極弱，而DNA分子幾乎沒有熒光.但當(dāng)溴化乙錠插入雙鏈DNA分子之后，溴化乙錠分子借助其與堿基之間的堆積作用而能平行地“固定”在DNA分子內(nèi)部，從而使溴化乙錠分子平面剛性增加，碰撞淬滅減小，發(fā)出的熒光強(qiáng)度大概提高了10倍［11］.溴化乙錠不能插入單鏈DNA中，而只能插入雙螺旋DNA分子中，因?yàn)樗cDNA的插入作用是通過堿基間堆積而產(chǎn)生的.因而溴化乙錠是一種能與DNA雙鏈發(fā)生專一插入作用，且選擇性好，靈敏度高的熒光探針.

如果配合物是以插入方式與DNA結(jié)合，那么就能與DNA發(fā)生類似EB的插入作用，從而競(jìng)爭EB與DNA結(jié)合的位點(diǎn)，釋放出EB，使EB/DNA復(fù)合體系熒光減弱:M+EB·DNA=M·DNA+EB.根據(jù)經(jīng)典斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程［12］:I0/I=1+Ksq·r. 其中:I和 I0分別代表復(fù)合物(配合物/EB/DNA)中存在和不存在配合物時(shí)的熒光強(qiáng)度;r為復(fù)合物中配合物與小牛胸腺DNA的濃度比;Ksq表示斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)淬滅常數(shù)，其可以定量描述配合物與DNA的作用強(qiáng)弱.從Ksq值的大小就可以定量地比較幾個(gè)化合物在相同條件下與DNA作用的強(qiáng)弱程度，Ksq值越大，作用強(qiáng)度越大，結(jié)合能力越強(qiáng).

配合物與DNA作用的熒光光譜圖見圖3.

圖3 配合物對(duì)DNA-EB體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Emission spectrum of EB bound to DNA in the presence of the complex

從圖3可以看出，隨著配合物濃度的增加，DNA-EB復(fù)合物的體系熒光強(qiáng)度逐漸減弱，且發(fā)生了一定程度的淬滅，并且濃度越大，熒光猝滅逐漸趨于平衡.當(dāng)配合物的濃度逐漸增加到最大時(shí)，配合物把DNA-EB復(fù)合物體系的熒光強(qiáng)度約由135淬滅到115，下降幅度為20.由斯特恩-沃爾默(Stern-Volmer)方程作圖，見圖4.配合物的斯特恩-沃爾默淬滅常數(shù)值(Ksq)為0.053 0.這一現(xiàn)象說明配合物與DNA發(fā)生了一定程度的插入作用，但作用微弱，說明配合物分子與DNA結(jié)合主要以靜電模式，同時(shí)存在一定的插入作用.

圖4 配合物對(duì)DNA-EB體系作用的stern圖Fig.4 Interaction with the DNA-EB system

2.4 凝膠電泳技術(shù)研究雙核鎳(Ⅱ)配合物對(duì)Hela細(xì)胞DNA的切割作用

在外電場(chǎng)作用下，帶電荷物質(zhì)會(huì)向著與其所帶電荷電性相反的電極移動(dòng).DNA中存有親水性的磷酸基團(tuán)，在高于其等電點(diǎn)的緩沖溶液中帶負(fù)電荷，從而使DNA在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極泳動(dòng).影響DNA在凝膠介質(zhì)中移動(dòng)的因素主要有電荷效應(yīng)、凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng).在電荷相同的條件下，凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)至關(guān)重要，其與相對(duì)分子質(zhì)量大小及構(gòu)型有關(guān);相對(duì)分子質(zhì)量越小，空間構(gòu)型產(chǎn)生的空間位阻越小，遷移位置就越靠前，而DNA帶間的距離也就越大.當(dāng)共價(jià)閉環(huán)型DNA的一條鏈上出現(xiàn)一個(gè)缺口時(shí)，超螺旋結(jié)構(gòu)解開，形成開環(huán)型結(jié)構(gòu);若2條鏈在同一位置發(fā)生斷裂時(shí)，則成為線形分子.某些能插入DNA雙螺旋堿基對(duì)之間的試劑如EB、放線菌素D可以改變DNA的超螺旋狀態(tài)，使負(fù)超螺旋減少，以至完全松開形成單鏈開環(huán)結(jié)構(gòu)，甚至形成正超螺旋，進(jìn)而能通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出來［13-14］.基于上述原理及前面的熒光法實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以凝膠電泳實(shí)驗(yàn)來研究配合物對(duì)DNA的切割作用.

配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5.在圖5中，Lane 0是純的 DNA，Lane 1～4分別為10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L 的配合物與DNA在有氧條件下反應(yīng)2 h的電泳圖像.隨著配合物濃度的增大，配合物使質(zhì)粒DNA的超螺旋帶(FormⅠ)和開環(huán)帶(FormⅡ)沒有明顯增多，而且無線性帶(FormⅢ)出現(xiàn).此結(jié)果可以看出，配合物對(duì)DNA的切割能力比較微弱，這個(gè)結(jié)果與上述的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)中的趨勢(shì)相一致，原因很有可能是 1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸是一個(gè)富電子的小平面結(jié)構(gòu)配體，配合物與DNA結(jié)合模式主要以靜電作用為主，插入作用相對(duì)較弱.

圖5 配合物對(duì)Hela DNA切割作用的電泳圖Fig.5 Cleavage of Hela DNA in the presence of complex

2.5 雙核鎳(Ⅱ)配合物對(duì)Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響研究

細(xì)胞凋亡［15-17］，又稱細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程.細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死，是程序性死亡過程的一種主要形式，強(qiáng)調(diào)的是形態(tài)學(xué)上的改變.將處理好的爬片放在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照.從圖6(a)可以看出，正常Hela細(xì)胞在染色后呈不規(guī)則的多角形，細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核完整，染色體均勻淡藍(lán)色，屬正常生長狀態(tài).圖6(b)是順鉑作用下Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，變小，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有出芽現(xiàn)象，并伴有凋亡小體.配合物作用過的細(xì)胞也發(fā)生了類似的變化(見圖6(c))，可明顯地觀察到凋亡的形態(tài)學(xué)特征.由此看出，Hela細(xì)胞在配合物的作用下發(fā)生了一定程度上的凋亡，但引起細(xì)胞凋亡的作用效果明顯沒有順鉑強(qiáng)烈.

圖6 Hela細(xì)胞培養(yǎng)48 h后經(jīng)染色在顯微鏡下的形態(tài)Fig.6 The shape of the staining of HeLa cells under the microscope after 48 h

3 結(jié)論

經(jīng)過對(duì)配合物與DNA作用的研究，表明雙核鎳(Ⅱ)配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O對(duì)DNA具有一定的結(jié)合能力，結(jié)合的作用模式主要以靜電作用為主，同時(shí)存在插入作用，是二者共同作用的結(jié)果.通過配合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響的研究，發(fā)現(xiàn)此配合物可以引起細(xì)胞一定程度上的程序性死亡，但細(xì)胞凋亡效果明顯沒有順鉑強(qiáng)烈.

［1］ Gao En-jun，Wang Lei，Zhu Ming-chang，et al.Synthesis，Characterization，Interaction with DNA and Cytotoxicity in Vitro of the Complexes［M(dmphen)(CO3)］H2O［M=Pt(Ⅱ)，Pd(Ⅱ)］［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45(1):311-316.

［2］ Barton Jacqueline K，Goldberg Jonathan M，Kumar Challa V，et al.Binding Modes and Base Specificity of Tris(phenanthroline)ruthenium(Ⅱ)Enantiomers with Nucleic Acids:Tuning the Stereoselectivity［J］.J.Am.Chem.Soc.，1986，108(8):2081-2088.

［3］ Gao En-jun，Zhu Ming-chang，Liu Lei，et al.New PH-dependent Complexes，from Mononuclear Pd(Ⅱ)Monomer to Heteronuclear［Pd(Ⅱ)，K(Ⅰ)］Polymer:DNA Cleavage and Cytotoxicity in Vitro［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:3261-3270.

［4］ Gao En-jun，Wang Ke-hua，Zhu Ming-chang，et al.Hairpin-shaped Tetranuclear Pallad Ium(Ⅱ)Complex:Synthesis，Crystal Structure，DNA Binding and Cytotoxicity Activity Studies［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:2784-2790.

［5］ Bakalova Adriana，Varbanov Hristo，Buyukliev Rossen，et al.Synthesis，Characterization and Biological Activity of Pt(Ⅱ)and Pt(Ⅳ)Complexes with 5-methyl-5(4-pyridyl)-2，4-imidazolidenedione［J］.Eur.J.Med.Chem，2008，43(5):958-965.

［6］ Pyle A M，Rehmann J P，Meshoyrer R，et al.Mixedligand Complexes of Ruthenium(Ⅱ):Factors Governing Binding to DNA［J］.J.Am.Chem.Soc.，1989，111(8):3051-3058.

［7］ Zhou Xin-hui，A Dinuclear Ni(Ⅱ)Complex［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O:Synthesis，Crystal Structure and Properties［J］.China.J.Inorg.Chem.，2010，26(5):801-806.

［8］ Gao En-jun，Sun Tie-dong.Synthesis，Characterization，Interaction with DNA and Cytotoxicity in Vitro of Novel Pyridine Complexes with Zn(Ⅱ)［J］.Eur.J.Med.Chem.，2010，45(10):4534-4536.

［9］ 吳紅星，李風(fēng)華，林華寬，等.二胺橋聯(lián)鄰菲啰啉衍生物的合成及其與DNA相互作用研究［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):117-122.

［10］李紅，樂學(xué)義，吳建中，等.銅(Ⅱ)鄰菲咯啉蛋氨酸配合物與 DNA相互作用研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，16:245-250.

［11］ Holder A A，Swavey S.Design Aspects for the Development of Mixed-metal Supramolecular Complexes Capable of Visible Light Induced Photocleavage of DNA［J］.Inorg.Chem.，2004，43(1):303-308.

［12］張黔玲，劉劍洪，任祥忠，等.新型雙核配合物的形成與DNA的作用機(jī)制及熒光性質(zhì)研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2006，64(10):968-974.

［13］王得寶，祁國榮.核酸:上冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1987:55.

［14］袁彩霞.DNA斷裂劑的合成與識(shí)別基寡聚脫氧核苷酸的偶聯(lián)及其作用機(jī)理［D］.太原:山西大學(xué)，2004.

［15］ Wu Kuang-shi，Liu Ji-hua，Johnson Russell N，et al.Drug-free Macromolecular Therapeutics:Induction of Apoptosis by Coiled-coil-mediated Cross-linking of Antigens on the Cell Surface［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49:1451-1455.

［16］ Jung Jongjin，Solanki Aniruddh，Memoli Kevin A，et al.Selective Inhibition of Human Brain Tumor Cells Through Multifunctional Quantum-dot-based SiRNA Delivery［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2010，49:103-107.

［17］彭黎明，王曾禮.細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:184-186.