固相萃取-反相高效液相色譜法測(cè)定紅毛丹中抑霉唑的殘留動(dòng)態(tài)

高智席，江忠遠(yuǎn)，李新發(fā)，吳艷紅，牟青松，敖克厚，鄧傳躍

(1.遵義師范學(xué)院化學(xué)系，貴州 遵義 563002；2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

固相萃取-反相高效液相色譜法測(cè)定紅毛丹中抑霉唑的殘留動(dòng)態(tài)

高智席1，江忠遠(yuǎn)1，李新發(fā)1，吳艷紅1，牟青松1，敖克厚1，鄧傳躍2

(1.遵義師范學(xué)院化學(xué)系，貴州 遵義 563002；2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

建立固相萃取-反相高效液相色譜法測(cè)定紅毛丹中抑霉唑的殘留動(dòng)態(tài)分析的方法。色譜柱為Shim-pack VPODS(150mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)229nm，流動(dòng)相為甲醇-離子對(duì)溶液(75:25，V/V)，流速0.85mL/min，進(jìn)樣量20μL。抑霉唑在15.0～960.0μg/L(r＝0.9994)范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，檢出限為5μg/L，抑霉唑回收率為86.4%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.84%～2.87%。同時(shí)，還對(duì)抑霉唑由紅毛丹皮向肉的遷移，在紅毛丹體上的降解動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。該方法操作簡(jiǎn)便快速，可作為紅毛丹中抑霉唑含量監(jiān)測(cè)的方法。

抑霉唑；固相萃??；反相高效液相色譜；紅毛丹

抑霉唑[烯丙基1-(2,4-二氯苯基)-2-咪唑-1-基乙基醚]是近年來(lái)開發(fā)的一種結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特、高效、低毒和廣譜的嘧啶胺類內(nèi)吸性殺菌劑，并具有預(yù)防和治療作用。對(duì)侵襲谷物、水果和蔬菜的病原體——交鏈孢菌、寄生霜霉、灰霉枝孢和霉根霉等具有良好的抑殺作用[1]。

紅毛丹是一種極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶水果，外觀美、營(yíng)養(yǎng)豐富、富含碳水化合物、各種維生素和礦物質(zhì)。長(zhǎng)期食用可潤(rùn)膚養(yǎng)顏、清熱解毒、增強(qiáng)人體免疫力。但紅毛丹在我國(guó)只有海南等少數(shù)地區(qū)分布，主要依賴東南亞進(jìn)口，儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)闹芷诒容^長(zhǎng)，保鮮能力又比較差。因此，抑霉唑常被應(yīng)用于紅毛丹收獲前和收獲后的生產(chǎn)、儲(chǔ)存及保鮮過(guò)程中。

通常測(cè)定抑霉唑的方法有高效液相色譜法[2-5]、氣相色譜法[6-12]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]等。但關(guān)于紅毛丹中抑霉唑殘留動(dòng)態(tài)分析的高效液相色譜測(cè)定方法未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立固相萃取反相高效液相色譜分離，二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定紅毛丹中抑霉唑殘留動(dòng)態(tài)分析的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

紅毛丹(市售)，0～5℃冷藏。

抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99%) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息中心；無(wú)水硫酸鈉(AR，130℃烘2h，貯于干燥器中備用)、甲醇(分析純)、磷酸(95%，分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、磷酸二氫鈉(99%，分析純)；二次蒸餾水。

所有溶液使用前均由0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾。離子對(duì)溶液：稱4.45g Na2H2PO4·2H2O溶于1000mL二次蒸餾水中，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%磷酸調(diào)至pH≈2.5，搖勻，超聲振蕩15min，用0.45μm的孔徑濾膜過(guò)濾，備用。

LC-2010AT型高效液相色譜儀(LCsolution色譜工作站，CBM-20A系統(tǒng)控制器，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器) 日本Shimadzu公司；SY3200超聲波清洗器 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；EYELAN-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidoph公司；電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；THZ-82A型振蕩機(jī) 江蘇富華儀器有限公司；DHG-9070A型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱寧波江南儀器廠；混合陽(yáng)離子固相萃取柱(PCX，HRXC，60mg，3mL)、24DL固相萃取裝置 Visiprep公司；微孔過(guò)濾裝置。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS(150mm× 4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇:離子對(duì)溶液=75:25(V:V)(pH≈2.5)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：229nm；流速：0.85mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

1.3 樣品前處理及測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品0.0401g(精確至0.0001g)，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后即為質(zhì)量濃度802μg/mL抑霉唑的儲(chǔ)備液。用移液管準(zhǔn)確移取不同體積的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25mL容量瓶中，再用甲醇定容得一系列不同濃度的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻并貼上標(biāo)簽，保存(0～10℃)，備用。

1.3.2 樣品前處理

樣品紅毛丹在802μg/mL抑霉唑溶液中蘸浸后取出，然后在間隔不同的時(shí)間將紅毛丹皮削下，將紅毛丹皮和紅毛丹肉分別編號(hào)并保存，樣品保存在冷藏柜里(0～5℃)。不同編號(hào)的樣品依次進(jìn)行殘留量測(cè)定。

將未經(jīng)清洗的紅毛丹肉與紅毛丹皮經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎，各稱取其5.00g(精確到0.01g)置于帶蓋塑料離心管中，準(zhǔn)確加入30mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1，V/V)和2g氯化鈉，在渦旋混合器上渦旋1min，超聲振蕩20min，在10000r/min離心機(jī)上離心10min，取上清液凈化。

分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，準(zhǔn)確移取3mL(具體由樣品含量高低來(lái)確定)離心上清液分別上PCX固相萃取柱，過(guò)柱速度1mL/min以內(nèi)。再用3mL水和3mL甲醇洗滌混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱[16]，抽近干后用氨水甲醇溶液5mL洗脫。在40℃條件下用氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入1.00mL甲醇溶液，渦旋振蕩1min，過(guò)0.45μm濾膜，待測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器在線掃描配制好的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，可得到抑霉唑的吸收波長(zhǎng)響應(yīng)值的紫外吸收?qǐng)D譜，最大吸光度出現(xiàn)在229nm處，產(chǎn)品中各雜質(zhì)在該波長(zhǎng)時(shí)對(duì)產(chǎn)品的測(cè)定無(wú)影響，且色譜峰形較好。因此，選擇229nm作為本方法的最適檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別以乙腈:離子對(duì)溶液和甲醇:離子對(duì)水溶液體系作流動(dòng)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)甲醇:離子對(duì)溶液作流動(dòng)相時(shí)，抑霉唑與其雜質(zhì)分離完全且峰形對(duì)稱；再經(jīng)過(guò)比較不同配比的甲醇:離子對(duì)水溶液體系[4]，發(fā)現(xiàn)甲醇-離子對(duì)溶液(75:25，V:V)，柱效最高，保留時(shí)間適宜。

2.3 流速選擇

在優(yōu)化流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)條件下，以0.30～1.30mL/min的不同流速進(jìn)行測(cè)定，分析比較發(fā)現(xiàn)在0.85mL/min流速下的抑霉唑液相色譜峰形較好、出峰時(shí)間較早，故選擇0.85mL/min為檢測(cè)流速。

2.4 線性范圍及檢出限

按照上述色譜條件，以質(zhì)量濃度為橫標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過(guò)回歸，得到其線性方程為Y＝15.502X－290.38，r＝0.9994。線性范圍為15～960.0μg/L。抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)出峰在2.1765min。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的最低濃度點(diǎn)，按上述色譜條件測(cè)定6次，得一組低濃度標(biāo)準(zhǔn)峰面積，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以方法的靈敏度，即得方法的檢出限為5μg/L。抑霉唑標(biāo)樣色譜圖和樣品色譜圖見圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和紅毛丹肉(B)中抑霉唑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of imazalil standard and imazalil in rambutan flesh

2.5 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，紅毛丹肉分別以0.01、0.05、0.1mg/kg 3個(gè)添加水平，紅毛丹皮分別以0.05、0.1、0.2mg/kg 3個(gè)添加水平，按照樣品處理方法進(jìn)行提取凈化，測(cè)定抑霉唑含量，計(jì)算回收率見表1。紅毛丹肉抑霉唑添加回收率在86.4%～102.3%，RSD(n=3)為1.5%～2.87%，紅毛丹皮抑霉唑添加回收率在88.9%～104.5%，RSD(n=3)為0.84%～1.46%，方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到滿意結(jié)果。在選定的色譜條件下，質(zhì)量濃度40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)測(cè)定5次，保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.15%和2.68%(n=5)。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重復(fù)性好，回收率穩(wěn)定，可以為紅毛丹樣品中抑霉唑的測(cè)定提供參考方法。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的上百個(gè)紅毛丹樣品進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

表1 回收率及精密度(n=3)Table 1 Recovery rates and RSDs of imazalil in rambutan peel and flesh (n=3)

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)樣品中紅毛丹肉和紅毛丹皮中的抑霉唑含量進(jìn)行測(cè)定，紅毛丹肉中含量2.36mg/kg，紅毛丹皮中含量21.34mg/kg。

2.7 紅毛丹中抑霉唑的降解曲線

從圖2可以看出，在30d內(nèi)，在紅毛丹肉中抑霉唑殘留量隨貯藏時(shí)間的推移，呈增加的趨勢(shì)，而在紅毛丹皮中呈下降趨勢(shì)，表明抑霉唑在不斷地從紅毛丹皮中轉(zhuǎn)移到紅毛丹肉中。第60天(最后一次分析)，抑霉唑殘留量在紅毛丹肉和紅毛丹皮中明顯降低。說(shuō)明紅毛丹中殘留的抑霉唑隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降解。

圖2 抑霉唑在紅毛丹中的殘留動(dòng)態(tài)曲線Fig.2 Residue dynamic curves of imazalil in rambutan

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立紅毛丹中抑霉唑的固相萃取-反相高效液相色譜殘留動(dòng)態(tài)分析的方法。該方法簡(jiǎn)單快速，精密度與靈敏度較高，是一種有效檢測(cè)水果采后的儲(chǔ)存過(guò)程中抑霉唑含量的有效方法。

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Residue Dynamic Analysis of Imazalil in Rambutan by RP-HPLC with Solid-Phase Extraction

GAO Zhi-xi1，JIANG Zhong-yuan1，LI Xin-fa1，WU Yan-hong1，MU Qing-song1，AO Ke-hou1，DENG Chuan-yue2
(1. Department of Chemistry, Zunyi Normal College, Zunyi 563002, China；
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A reversed-phase high performance liquid chromatographic method with solid-phase extraction was proposed for the residue dynamic analysis of imazalil in rambutan. The analyte was separated on a Shim-pack VP-ODS (150 mm × 4.6 mm,5 μm) using a mobile phased composed of a mixture at a volume ratio of 75:25 of methanol and acidic Na2H2PO4 solution approximately at pH 5 (adjusted with 85% phosphoric acid) at a flow rate of 0.85 mL/min, and detected at 229 nm. The injection amount was 20 μL. An excellent linearity of imazalil in the range of 15.0－960.0 μg/L was achieved (r ＝0.9994). The detection limit was 5.0 μg/L. The average spike recovery rates were in the range of 86.4%－104.5% with relative standard deviation of 0.84%－2.87%. The method was fast, simple, and applicable for the determination of imazalil residue in rambutan.

imazalil；solid-phase extraction；RP-HPLC；rambutan

O657.72

A

1002-6630(2012)08-0188-03

2011-05-30

貴州省遵義市科技局項(xiàng)目([2008]26號(hào))；貴州省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目([2010]085號(hào))

高智席(1969—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：wyhgzx@163.com