超聲波輔助乙醇提取垂盆草中總黃酮及其抗氧化活性

張俊生，陳莉華，侯孝璇，段琛圭，何 莉

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

超聲波輔助乙醇提取垂盆草中總黃酮及其抗氧化活性

張俊生，陳莉華，侯孝璇，段琛圭，何 莉

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

用超聲波輔助乙醇提取湘西垂盆草中的總黃酮。通過單因素和正交試驗討論料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間、溫度等因素對提取效果的影響，考察黃酮提取物對油脂的抗氧化性能及對羥自由基的清除效果，并與一些天然抗氧化劑作比較。結(jié)果表明：在80℃條件下，選擇40%乙醇為提取劑、料液比1:25(g/mL)、超聲40min，提取率達到1.968%。提取物對羥自由基的清除作用明顯，并能增加植物油和動物油的抗氧化能力，在相同條件下該提取物對油脂的抗氧化效果強于檸檬酸而弱于VC。

垂盆草；總黃酮；油脂；羥自由基；抗氧化

垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)為景天科多年生肉質(zhì)草本植物，收載于《中國藥典》2005版一部[1]，具有保肝護肝、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等作用[2-4]。垂盆草中含多種化學(xué)成分，包括生物堿、三萜類、垂盆草苷及黃酮類成分等[4-6]。近期研究認為垂盆草苷與黃酮類成分均為抗肝炎活性成分[4]，垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性部位之一，并有明顯的保護肝臟的作用[7]。黃酮類化合物除具有通常的抗菌、清熱解毒、抑制脂肪氧化酶等生物活性外，在油脂抗氧化方面也有顯著效果，從植物中提取安全、天然的黃酮類物質(zhì)以取代人工合成抗氧化劑是油脂或含油食品添加劑的發(fā)展趨勢[8-11]。

本實驗提取垂盆草中總黃酮，并研究提取物對羥自由基(·OH)的清除作用及對油脂的抗氧化作用，以期為垂盆草的進一步開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

垂盆草、豬油、植物油 市購。

無水乙醇、鞣酸、檸檬酸、K I、冰醋酸、三氯甲烷、NaOH、HCl、NaNO2、石油醚、Al(NO3)3、FeSO4、H2O2、水楊酸等均為分析純。

Gzx-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV75TCRT紫外分光光度計 日本島津公司；K-201B-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-250E型超聲波清洗機；電子天平；FM-1植物粉碎機。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取及含量測定

將清除雜質(zhì)后的垂盆草放于藥盤內(nèi)，放入60℃溫度下于數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中烘干。用植物粉碎機粉碎，準確稱取垂盆草粉末1g，放于250mL錐形瓶中，加入不同體積分數(shù)的乙醇水溶液，在超聲波的協(xié)同下提取，抽濾得到粗液，用石油醚萃取除去色素并分離，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙醇并回收再利用，得到高濃度的醇提液。

1.2.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為對照品，按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[12-13]繪制蘆丁標準曲線，測定提取物中總黃酮含量。黃酮質(zhì)量濃度(c)在0～0.05mg/mL范圍內(nèi)與吸光度(A)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：c＝0.0939A，R2＝0.9998。

1.2.3 總黃酮清除羥自由基能力測定

參照Fenton反應(yīng)[14]建立羥自由基生成模型，在15mL比色管中依次加入3mL 2mmol/L FeSO4，3mL 6mmol/L H2O2，搖勻，接著加入9mL 6mmol/L水楊酸溶液。加入1mL蒸餾水，未加粗提取物比色管所測的吸光度為A0，其余比色管根據(jù)實驗條件加入不同濃度的提取物1mL，在40℃水浴中放置15min后取出，以蒸餾水為參比，于波長510nm處測吸光度Ax。

式中：Ax為加入提取液后的吸光度；A0為空白對照的吸光度。

1.2.4 過氧化值的測定

在無水酸性條件下，油脂中的過氧化物使I－定量氧化成I2，I2與I－結(jié)合生成易溶于水的I3－，利用I3－的吸光度與標準碘液吸光度進行比較定量。

按照文獻[15]方法，在353nm波長下，I2含量(W/μg)對吸光度(A)的線性回歸方程為：A＝0.00435W－0.24996，R2＝ 0.9875。

黃酮提取物對油脂的抗氧化性：采用國際上通用的烘箱強化貯存法[6-7]。用適量濃度的黃酮提取溶液加到溫?zé)釀游镉突蛑参镉椭?，攪勻，在恒溫箱中儲存，以不加任何抗氧化劑作對照組，不同時間取樣測定動物油與植物油的過氧化值。另分別用VC和檸檬酸溶液按上述方法測定過氧化值，比較各種抗氧化劑的抗氧化能力。

在100mL三角瓶中加入24mL油-黃酮溶液(5:1，V/V)。在一定條件下反應(yīng)，間隔70min取待測樣品(大約3滴．不超過0.12g)于干燥的15mL比色管中，加入氯仿-冰醋酸溶液3mL，混勻，加入KI飽和堿液0.12mL，輕搖30s，置暗處3min。然后加蒸餾水至刻度，加塞，顛倒混勻2～3次，靜置約5～l0min，待水相澄清后，取上清液于1cm石英比色皿中，在353nm處以空白作參比，讀取各管的吸光度A并計算出碘生成量，按下式計算過氧化值(peroxide value，POV)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

以垂盆草總黃酮的提取率為指標，在40W超聲功率、13kHz超聲頻率及250W加熱功率的條件下，考察不同的料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間、溫度等各單因素對其提取率的影響。

2.1.1 料液比對提取的影響

精密稱取垂盆草粉末1.000g，按不同的料液比(垂盆草粉質(zhì)量50%乙醇溶液體積g/mL)加入50%乙醇溶液，在溫度80℃條件下超聲協(xié)同萃取20min，過濾，收集濾液，用50%乙醇溶液定容至50mL，測定總黃酮并計算提取率。考察了不同料液比對黃酮提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

隨著料液比的增大，黃酮的提取率也逐漸上升，當上升到1:20(g/mL)后，提取率開始下降。為提高生產(chǎn)成本以及不浪費溶劑，后續(xù)實驗選用1:20的料液比進行提取。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響

圖2 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖2可以看出，黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的增大而增大，在乙醇體積分數(shù)50%時達到最大，此后乙醇體積分數(shù)再增大提取率反而降低。所以選用50%乙醇溶液作為提取溶劑。

2.1.3 超聲時間對黃酮提取率的影響

超聲波獨具的物理特性能促使植物細胞組織破壁或變形，短時間內(nèi)即可獲得最佳提取率，在40W超聲功率、13kHz超聲頻率條件下超聲時間對黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 超聲時間對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，黃酮提取率隨超聲時間增大而增大，在20min時達到極值，此后在20～60min時間內(nèi)，提取率隨超聲時間增大反而降低。原因可能為：有效成分濃度差是超聲提取的主要動力，在提取初期，有效成分濃度差大，超聲時間增大則提取率也增加明顯；隨著提取時間的延長，溶劑中有效成分濃度逐漸增大，與固相中的濃度差逐漸變小，所以提取率慢慢降低，且隨著超聲時間延長，超聲過程不斷產(chǎn)熱，黃酮類物質(zhì)本身易被氧化破壞使其活性成分造成損失，也使總黃酮提取率減??；但當超聲時間太長(70min)時，超聲波的作用促使或加速某些化學(xué)反應(yīng)生成某些還原性物質(zhì)(如染料的水溶液經(jīng)超聲處理后會變色或退色)，使提取率又略有提高，選用超聲時間20min。

2.1.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

圖4 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，黃酮提取率隨超聲溫度增大先緩慢增大，在70～80℃時急劇增大，并在80℃達到極值，此后溫度再升高提取率反而急劇降低。由于80℃左右溫度的變化導(dǎo)致提取率變化幅度較大，且溫度過高容易導(dǎo)致活性物質(zhì)失效，故選擇70℃為宜。

2.2 垂盆草中黃酮提取正交試驗及驗證實驗

2.2.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用L9(34)正交表，選取料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲波處理溫度、超聲時間為考察因素，因素水平表如表1所示，結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 垂盆草黃酮提取工藝L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests

由表2可知，超聲波技術(shù)提取垂盆草中黃酮各因素對提取率影響的主次順序為：A＞D＞B＞C，即乙醇體積分數(shù)＞料液比＞超聲時間＞提取溫度，并由k值得出超聲波輔助提取垂盆草中黃酮的最佳工藝方案為A2B3C3D2。

2.2.2 驗證實驗

采用最佳工藝條件進行驗證實驗，平行提取3次，提取率分別為1.968%、1.963%、1.970%，結(jié)果表明該工藝條件穩(wěn)定性好，重現(xiàn)度高。

2.3 黃酮對羥自由基的清除研究

2.3.1 質(zhì)量濃度對羥自由基的清除效果的影響

圖5 提取物質(zhì)量濃度對羥自由基清除作用的影響Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging capacity of total flavonoids extract at various concentrations

由圖5可知，垂盆草提取物有很強的清除羥自由基的作用，且黃酮提取物質(zhì)量濃度越大，對羥自由基的清除能力越強，在35～285μg/mL范圍內(nèi)清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

2.3.2 溫度對垂盆草黃酮清除羥自由基效果的影響

以質(zhì)量濃度213.7μg/mL的黃酮提取物研究溫度對黃酮清除羥自由基效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 溫度對垂盆草黃酮清除羥自由基效果的影響(黃酮提取物213.7μg/mL)Table 3 Effect of temperature on hydroxyl free radical scavenging capacity (at 213.7 μg/mL)

由表3可知，溫度對清除率有較大影響。溫度越高，垂盆草對黃酮羥自由基的清除率越小，在30℃時的清除率最大。原因可能是溫度逐漸升高時黃酮本身氧化加劇，減弱了對羥自由基的清除能力，當高溫(80℃)時，黃酮結(jié)構(gòu)完全破壞，完全失去對羥自由基的清除能力并被羥自由基所影響，使清除率反而為負值。

2.4 黃酮對油脂的抗氧化性研究

2.4.1 烘箱強制保溫時間對黃酮抗油脂氧化的影響

40℃條件下，將植物油及動物油在烘箱強制保溫一定時間，在不同時間段取出測定過氧化值，試驗黃酮提取物對油脂的抗氧化性，結(jié)果見表4、5。

表4 黃酮提取物對動物油的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of total flavonoids extract on fat

表4表明，在烘箱強化保存時間越長，動物油的過氧化值越高，說明油脂氧化程度越大；添加黃酮后，過氧化值均有不同程度的下降，說明黃酮提取物對油脂的氧化均有不同程度的抑制作用；同樣濃度的黃酮提取物能使在烘箱放置時間長達510min、氧化程度很高的油脂其過氧化值降低23.30%，說明黃酮對氧化程度很深的動物油有較好的保護作用。

表5 黃酮提取物對植物油的抗氧化活性Table 5 Antioxidant activity of total flavonoids extract on oil

表5表明，在烘箱強化保存時間越長，植物油的過氧化值越高，說明油脂氧化程度越大；添加黃酮后，過氧化值均有不同程度的下降，說明黃酮提取物對油脂的氧化均有不同程度的抑制作用；同樣濃度的黃酮取物使植物油過氧化值降低最大只有8.43%，說明黃酮對植物油有較好的保護作用，但保護作用不像對動物油的保護作用那么大。

2.4.2 垂盆草黃酮質(zhì)量濃度對油脂抗氧化性的影響

圖6 垂盆草黃酮質(zhì)量濃度對動物油(A)和植物油(B)抗氧化性的影響Fig.6 Effect of dose on POV of fat and oil in the presence of total flavonoids extract

由圖6可知，當烘箱強制放置時間相同時，垂盆草黃酮質(zhì)量濃度越大，則油脂的POV值越小，當放置時間為220min時，0.3524mg/mL黃酮使動物油的POV降低4.60%，0.7952mg/mL的黃酮使動物油的POV降低29.81%；當放置時間430min時，0.3524mg/mL黃酮使動物油的POV降低3.88%，0.7952mg/mL的黃酮使使動物油的POV降低11.02%。圖6曲線變化趨勢顯示，盡管有抗氧化劑存在，但隨著在烘箱強制放置時間越長，油脂的氧化程度越來越大，表明黃酮對油脂的抗氧化程度不但受黃酮濃度影響同時也受在烘箱強制放置時間長短的影響。

2.4.3 不同溫度對黃酮抗油脂氧化的影響

圖7 不同溫度下黃酮對動物油(A)和植物油(B)的保護率Fig.7 Protection rate of total flavonoids extract on fat and oil at different temperatures

圖7表明，黃酮能較好的保護動物油(圖7A)，當烘箱溫度升高且放置時間延長時，保護率呈總體上升趨勢，而溫度升高黃酮對植物油脂(圖7B)的保護率下降，且隨在烘箱放置時間延長，保護效果越來越弱。

2.5 黃酮提取物與其他抗氧化劑的比較

在烘箱溫度40℃條件下，將添加了垂盆草黃酮、檸檬酸、VC溶液的油樣在烘箱強化保存了不同時間后，檢測了植物油(圖8A)及動物油(圖8B)的過氧化值。

圖8 不同抗氧化劑對植物油(A)及動物油(B)抗氧化性的影響Fig.8 Comparative antioxidant effects of total flavonoids extract and several natural antioxidants on oil and fat

圖8表明，不同的抗氧化劑對植物油的抗氧化能力不同，在烘箱放置時間小于100min時，檸檬酸的抗氧化能力強于垂盆草提取物，其他時間段，特別是放置時間超過210min后，垂盆草黃酮與比常用的檸檬酸、VC的抗氧化能力強，使POV值降低更大，在動物油中垂盆草黃酮抗氧化能力比檸檬酸強比VC弱。

3 結(jié) 論

結(jié)果表明，選擇40%乙醇為提取劑、料液比1:25(g/mL)、40W超聲功率超聲40min，垂盆草總黃酮提取率達到1.968%。該提取物能很好地清除羥自由基和抑制油脂的氧化作用，對動物油脂的抗氧化能力稍弱于VC強于檸檬酸，對植物油的抗氧化能力則強于檸檬酸與VC。垂盆草黃酮是天然抗氧化劑，作為食品添加劑，不僅可以延長食品的貯存時間，而且具有保健功效，符合當前的綠色低碳環(huán)保的生活理念。

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Ultrasonic-Assisted Ethanol Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sedum sarmentosum Bunge

ZHANG Jun-sheng，CHEN Li-hua，HOU Xiao-xuan，DUAN Chen-gui，HE Li
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

s：Total flavonoids were extracted from Sedum sarmentosum Bunge using ethanol as extraction solvent with the aid of ultrasonic treatment. The effects of the extraction parameters material-to-liquid ratio (g/mL), ethanol concentration, ultrasonic treatment time and extraction temperature on extraction efficiency were explored by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The lipid peroxidation inhibitory activity and hydroxyl free radical scavenging activity of total flavonoids extract were evaluated and compared with those of several natural antioxidants. The extraction rate of total flavonoids was up to 1.968% after 40 min of ultrasonic treatment for extraction with 40% ethanol at 80 ℃ and a material-to-liquid ratio of 1:25. The resulting extract revealed obvious scavenging activity on hydroxyl free radicals and antioxidant effect on oil and fat. Under the same conditions, it was superior to citric acid but inferior to vitamin C in terms of antioxidant effect on oil and fat.

Sedum sarmentosum Bunge；total flavonoids；extraction；fat and oil；hydroxyl free radicals；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2012)08-0018-06

2011-03-21

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(10C26214302421)

張俊生(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為天然植物中生理活性成分提取分離及應(yīng)用。E-mail：zhangjunshenggirl@163.com