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    海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

    2012-10-27 03:08:10郝志鵬馬麗杰王英麗包海泉
    食品科學 2012年18期
    關鍵詞:紅果清除率自由基

    郝志鵬,馬麗杰,吳 敬*,王英麗,包海泉

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

    海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

    郝志鵬1,2,馬麗杰2,吳 敬1,*,王英麗1,包海泉1

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

    目的:探討海紅果多糖(polysaccharide fromMalus prunifoliaBorkh,PFM)提取工藝條件及其體外抗氧化活性。方法:采用三因素三水平正交試驗設計,考察提取溫度、時間和料液比3個因素對海紅果多糖提取工藝的影響;以VC為對照,應用DPPH法測定海紅果多糖清除有機自由基能力、ABTS法測定其總抗氧化能力、Fenton反應測定其清除羥自由基能力。結果:PFM最佳提取工藝條件為提取溫度90℃、提取時間6h、料液比1:10(g/mL),此條件下PFM得率為6.75%;PFM對羥自由基具有較強的清除作用(P<0.05),效果優(yōu)于清除DPPH自由基和ABTS+自由基,但弱于VC。結論:優(yōu)化海紅果提取工藝得到的PFM具有較強的體外抗氧化活性。

    海紅果;多糖;提?。惑w外抗氧化

    海紅果是薔薇科蘋果屬楸子(Malus prunifolia(wild) Borkh)的果實,又名海紅、海棠果[1-3],在我國主要分布在晉、陜、蒙三省(區(qū))交界處,如山西保德、河曲、偏關,陜西府谷、內(nèi)蒙古準格爾旗等,在呼和浩特市的清水河縣有種植基地。海紅果營養(yǎng)豐富,經(jīng)常食用可健胃消食、增強食欲,軟化血管。某些地區(qū)以海紅果代替山楂入藥,具有醒腦提神、去膩除腥的功效[4-5]。

    關于海紅果的報道目前以海紅果提取黃酮類為主[6-8],有關海紅果多糖(polysaccharide fromMalusprunifoliaBorkh,PFM)的體外抗氧化作用國內(nèi)未見報道。本實驗采用3種體外抗氧化作用評價方法對PFM進行檢測,以抗壞血酸VC作為陽性對照,共同評價海紅果多糖體外抗氧化作用[9],為今后海紅果深加工及其相關領域的深入研究或開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    海紅果購于內(nèi)蒙古呼和浩特市清水河縣,新鮮優(yōu)質(zhì)海紅果清洗,去掉果核,果肉切片,6 0℃烘干,粉碎,過6 0目篩備用。

    1,1-二苯基-2-三硝苯肼(DPPH)、ABTS、過硫酸鉀 美國Sigma公司;羥自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他化學試劑均為分析純。

    T6-新銳可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DHG-9075A型真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有公司醫(yī)療設備廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;AL204型臺式電子分析天平;TG-16-WS型臺式高速離心機;HY-08高速粉碎機。

    1.2 方法

    1.2.1 水提醇沉法提取海紅果多糖

    取10g樣品粉末按料液比1:30置于250mL圓底燒瓶中,水浴提取(6h、90℃),過濾合并濾液,濃縮至原體積1/4加入5倍體積95%乙醇醇沉24h,離心(8000r/min、15min),分別用無水乙醇、丙酮沖洗2~3次,得海紅果粗多糖,粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白(氯仿:正丁醇=1:5,V/V)比例混合,劇烈振搖20min,離心10min(8000r/min),棄去下層有機相和蛋白沉淀層,取上層多糖水溶液再次用相同的方法重復操作一次,得到去蛋白的多糖溶液,后用80%乙醇沉淀、洗滌離心后干燥得PFM,備用。

    1.2.2 PFM提取的單因素試驗

    1.2.2.1 提取料液比的選擇

    稱取5份海紅果粉末各1g,在時間6h、提取溫度90℃條件下,分別以1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)的料液比進行試驗,考察料液比對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

    1.2.2.2 提取時間選擇

    稱取5份海紅果粉末各1g,料液比1:30,提取溫度90℃的條件下,分別以2、3、4、5、6h進行試驗,考察提取時間對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

    1.2.2.3 提取溫度的選擇

    稱取5份海紅果粉末各1g,料液比1:30、提取時間6h條件下,分別以50、60、70、80、90℃五個溫度進行試驗考察提取溫度對產(chǎn)品中PFM得率的影響。

    1.2.3 海紅果多糖提取工藝正交試驗

    根據(jù)海紅果性質(zhì)和生產(chǎn)要求,擬定影響海紅果浸出效果的3個因素即為料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為優(yōu)選因素,每個因素3個水平進行L9(34)正交試驗,因素水平見表1。

    表1 海紅果多糖提取工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels for orthogonal array design

    1.2.4 PFM得率的測定

    應用苯酚硫酸法測定PFM含量[10]。

    1.2.4.1 葡萄糖標準溶液的配制

    精確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的標準葡萄糖0.1000g,置于100mL量瓶中,加蒸餾水溶解并稀釋至刻度,葡萄糖質(zhì)量濃度1.0mg/mL,在使用前稀釋成葡萄糖質(zhì)量濃度0.1mg/mL。

    1.2.4.2 5%苯酚液的制備

    取苯酚200g,加鋁片0.2g、碳酸氫鈉0.1g,蒸餾收集182℃餾分,稱取此餾分12.5g,加蒸餾水250mL,置棕色瓶中備用。

    1.2.4.3 標準曲線的制備

    精確量取葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置具塞試管中。各加蒸餾水加至1mL,在分別加入5%的苯酚液0.6mL,濃硫酸3.6mL,振蕩混勻,沸水加熱30min,取出后迅速冷卻至室溫,用可見分光光度法在490nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標,以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得標準曲線的回歸方程:y=0.0855x+0.0973,R2=0.9982。結果表明,在1~5mg/mL范圍內(nèi)吸光度與質(zhì)量濃度線性關系良好。

    1.2.4.4 海紅果多糖得率的測定

    用蒸餾水溶解海紅果粉末樣品20mg,按照優(yōu)化工藝處理得PFM定容至100mL,精密吸取溶液3份,每份1mL,加水至2mL,再加入0.6mL 5%苯酚溶液,搖勻,迅速加入濃硫酸3.6mL搖勻,沸水加熱30min,取出后迅速冷卻至室溫,另取2mL蒸餾水做對照,然后在波長490nm處測定吸光度,按下式計算樣品溶液中多糖得率。

    式中:C為供試溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL);D為供試溶液的稀釋倍數(shù);F為換算因子取值為0.9;m為海紅果粉末樣品質(zhì)量/mg。

    1.2.5 PFM體外抗氧化活性實驗

    1.2.5.1 PFM和VC溶液的配制

    精確稱取PFM,用適量蒸餾水充分溶解,制成質(zhì)量濃度1.0mg/mL的母液A,取母液A稀釋,質(zhì)量濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

    精確稱取VC溶液,用適量蒸餾水充分溶解,制成質(zhì)量濃度1.0mg/mL的母液B,取母液B稀釋,質(zhì)量濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

    1.2.5.2 PFM體外抗氧化活性測定

    依據(jù)試劑盒及文獻方法,對各溶液分別應用DPPH法測定總抗氧化能力[11],ABTS法測定海紅果多糖總抗氧化能力[12-13],F(xiàn)enton反應測定對羥自由基清除能力。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理。

    2 結果與分析

    2.1 海紅果粗多糖提取條件的單因素試驗

    2.1.1 料液比對多糖得率的影響

    圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction rate of polysaccharides

    由圖1可知,在料液比1:10~1:30范圍內(nèi),隨著液體比例的增加,溶質(zhì)的擴散動力增加,多糖提取率明顯上升,因此提取以料液比1:30為宜。

    2.1.2 提取時間對多糖提取的影響

    圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

    由圖2可知,提取時間為6h,多糖提取量較多,因此,提取時間以6 h為宜。

    2.1.3 提取溫度對多糖提取的影響

    圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides

    由圖3可知,溫度是影響多糖提取的關鍵因素之一,在溫度為50~90℃的范圍內(nèi),海紅果多糖含量隨溫度的升高而增加。因此將溫度確定為90℃。

    2.2 海紅果多糖提取工藝正交試驗

    參照單因素試驗結果,以影響海紅果多糖得率的料液比、提取溫度、提取時間3因素進行正交試驗,試驗設計及結果見表2。

    表2 海紅果多糖L9(34)提取工藝優(yōu)化正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design scheme and corresponding results

    由表2可見,影響海紅果多糖得率的3個因素主次順序為RB>RA>RC,最優(yōu)組合為A1B3C3,即PFM提取工藝確定為提取時間6h、提取溫度90℃、料液比1:10(g/mL),此條件下多糖得率為6.75%。

    2.3 PFM總抗氧化能力測定

    2.3.1 PFM清除游離DPPH自由基的能力

    DPPH法常用于測定生物試樣和食品的抗氧化能力。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基,其溶液具有獨特的紫紅色特征吸收峰,并在波長517nm測定其吸光度。當有自由基清除劑存在時,由于與其單電子配對使其褪色,褪色程度與接受的電子數(shù)量成定量關系,因而可用分光光度計進行快速的定量分析。

    表3 DPPH法測定海紅果多糖與VC對自由基清除的結果Table 3 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on DPPH free radicals

    由表3可見,質(zhì)量濃度為0.8、0.6mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.4mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.05);質(zhì)量濃度在1、0.2mg/mL時,PFM與VC之間清除率無顯著差異。

    2.3.2 PFM清除ABTS+自由基的能力

    ABTS經(jīng)活性氧化后生成ABTS+自由基,是一種穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基,加入樣品后,被測物質(zhì)存在抗氧化成分,則該物質(zhì)會與ABTS+發(fā)生反應使體系逐漸褪色,抗氧化能力越強其供電子能力越強,反應自由基能力越大,反應速率也越快,因此可以通過測定吸光度值直接反應樣品還原能力的大小[14]。

    表4 ABTS法測定PFM與VC對自由基清除的結果Table 4 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on ABTS free radicals

    由表4可見,質(zhì)量濃度1mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.8mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.05);質(zhì)量濃度在0.6、0.4、0.2mg/mL時,PFM與VC之間清除率無顯著差異。

    2.3.3 PFM清除羥自由基的能力

    羥自由基是國際學者們公認的毒性最強的活性氧自由基,是生物有機體過氧化損傷的主要因素[15]。由表5可見,質(zhì)量濃度1、0.6mg/mL時,PMM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.8、0.4、0.2mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.05)。

    表5 PFM與VC對羥自由基清除的結果Table 5 Comparison of the scavenging effects of PMM and vitamin C on hydroxyl free radicals

    2.3.4 海紅果多糖對3種自由基清除能力的比較

    表6 PFM對3種自由基清除能力的比較Table 6 Comparison of the scavenging effects of PFM on three types of free radicals

    由表6可見,質(zhì)量濃度1mg/mL時PFM對3種自由基清除能力有顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.6、0.4mg/ mL時,PFM對3種自由基清除能力有顯著差異(P<0.05)。在質(zhì)量濃度0.8、0.2mg/mL時,二者清除率差別無統(tǒng)計學差異。

    3 討論與結論

    3.1 通過正交試驗設計對PFM提取工藝進行優(yōu)化,最佳工藝條件為提取時間6h、提取溫度90℃、料液比1:10,多糖得率為6.75%。

    3.2 以抗壞血酸(VC)為對照,采用DPPH法、ABTS法、羥自由基法測定海紅果多糖有效清除自由基的清除能力,結果表明海紅果多糖對羥自由基具有較強的清除作用(P<0.05),其抗氧化作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強,但抗氧化效果不及VC。DPPH自由基清除能力實驗表明,質(zhì)量濃度0.8、0.6mg/mL時,PFM與VC之間清除率有極顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.4mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.05);ABTS+自由基清除能力實驗表明,質(zhì)量濃度1mg/mL時,PFM與VC之間清除率有極顯著差異(P<0.01);質(zhì)量濃度0.8mg/mL時,PFM與VC之間清除率有顯著差異(P<0.05);抗氧化的作用可以通過多種途徑來進行評價,不同的評價系統(tǒng)其原理不相同。PFM對3種自由基的清除率在多數(shù)濃度下差異不顯著,綜合來看,清除羥自由基的效果要優(yōu)于清除ABTS+和DPPH自由基。實驗證實了PFM的體外抗氧化活性。

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    Extraction andin vitroAntioxidant Activity of Polysaccharides from Dried Pulp ofMalus micromalusMakino

    HAO Zhi-peng1,2,MA Li-jie2,WU Jing1,*,WANG Ying-li1,BAO Hai-quan1
    (1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;2. Teaching and Research Office of Basis Pharmacology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China)

    Objective: To explore optimal extraction process andin vitroantioxidant activity of polysaccharides from dried pulp ofMalus micromalusMakino (PMM). Methods: A three-factor, three-level orthogonal array design was used to investigate the effects of three extraction conditions including temperature, time and solid-to-solvent ratio on polysaccharide yield. In order to assess thein vitroantioxidant activity of PMM using vitamin C as control, their DPPH radical scavenging activity was measured and meanwhile, their total antioxidant capacity and hydroxyl radical scavenging activity of PMM were tested by ABTS assay and Fenton reaction, respectively. Results: The optimal conditions for the extraction of polysaccharides from dried pulp ofMalus micromalusMakino were 6 h extraction at 90 ℃ and a solid-to-solvent ratio of 1:10 (g/mL), resulting in a polysaccharide yield of 6.75%. Although its antioxidant activity was weaker than that of vitamin C, PMM still revealed strong scavenging effect on hydroxyl, DPPH and ABTS+free radicals. PPM was more effective in scavenging hydroxyl free radicals than DPPH and ABTS+free radicals. Conclusion: The developed optimal procedure for the extraction of PMM is reliable. PMM has a strong antioxidant activityin vitro.

    Malus micromalusMakino;polysaccharide;extraction;antioxidant activityin vitro

    TQ929.2

    A

    1002-6630(2012)18-0088-05

    2011-06-29

    郝志鵬(1982—),女,藥劑師,碩士,研究方向為中蒙藥藥理學。E-mail:117647392@163.com

    *通信作者:吳敬(1969—),女,副教授,博士,研究方向為食品生物技術及功能食品。E-mail:wujing2003825@yahoo.com.cn

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