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    復合酶法提取海帶多糖工藝優(yōu)化

    2012-10-27 03:25:48張美雙張莉霞張連學
    食品科學 2012年18期
    關(guān)鍵詞:果膠酶酶法海帶

    翟 為,張美雙,張莉霞,趙 巖,*,吳 鵬,張連學,*

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院,吉林 長春 130118;2.九江中星聯(lián)生物技術(shù)有限公司,江西 九江 332000)

    復合酶法提取海帶多糖工藝優(yōu)化

    翟 為1,張美雙1,張莉霞1,趙 巖1,*,吳 鵬2,張連學1,*

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院,吉林 長春 130118;2.九江中星聯(lián)生物技術(shù)有限公司,江西 九江 332000)

    以海帶為原料,復合酶法提取海帶多糖。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用正交試驗及方差分析確定復合酶法提取海帶多糖的最佳條件:纖維素酶0.5%、果膠酶1.0%、木瓜蛋白酶1.0%、木聚糖酶1.0%、溫度30℃、時間3h、pH 5.0。在此條件下,海帶中多糖的提取率為78.9%。使用復合酶前處理工藝,海帶多糖產(chǎn)率較傳統(tǒng)工藝提高了近3倍。

    海帶;復合酶;海帶多糖

    海帶(Laminaria Japonica)又名昆布,屬于褐藻門、海帶科、海帶目,是一種大型的可食用藻類,具有很高的經(jīng)濟價值[1]。早在 1400 多年前,我國人民就逐漸對海帶的食用性能有所認識,在《本草經(jīng)疏》和《食療本草》等專著中都有海帶功能的記載[2-3]。現(xiàn)代藥理學、醫(yī)學和食品營養(yǎng)學的研究已經(jīng)揭示,海帶具有多方面的生物活性,如:降血糖[4]、降血脂、降血壓[5-6]、抗凝血[7-8]、抗腫瘤[9-11]、抗菌、病毒[12]、調(diào)節(jié)免疫、抗輻射[13-14]等,這些功能在很大程度上與其所含有的生理活性物質(zhì)——多糖有關(guān)。因而,如何能從海帶中最大限度地提取多糖,且不破壞多糖的生物活性,對保持細胞健康,延長細胞壽命,從而實現(xiàn)人體健康有重要的意義。

    目前,世界范圍內(nèi)提取海帶多糖方法大部分屬于純化學方法[15-16],此法提取海帶多糖由于降解問題不僅產(chǎn)率普遍較低(一般在20%左右),而且大量的酸堿化學藥品對環(huán)境的污染較大。而酶作為一種特殊的以蛋白質(zhì)形式存在的生物催化劑,在啤酒、果汁果酒、紡織、飼料、皮革、酒精生產(chǎn)等行業(yè)得到了廣泛的應用,并以其特異、高效、綠色環(huán)保等特點而備受青睞。目前酶解提取法提取海帶多糖還不夠成熟,僅有少量的文獻報道使用單一酶進行水解的方法[17-18],但組成植物細胞壁的有纖維素酶、半纖維素酶、果膠、木質(zhì)素等成分,他們之間的鏈接方式或者鑲嵌,或者抱合,所以用單一的酶很難徹底破解植物的細胞壁,不能使內(nèi)容物完全釋放。因此,本研究以蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶按科學的配比制成復合酶,對原料進行預處理,對海帶中多糖提取工藝進行優(yōu)化,從而得出最佳工藝條件。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    海帶,選用市場上出售的干燥完整的海帶。

    木瓜蛋白酶(2×106U/g)、纖維素酶(2.6×105U/g)、果膠酶(4×104U/g)、木聚糖酶(3×105U/g) 江西九江中星聯(lián)生物科技有限公司;濃鹽酸、濃硫酸等試劑均為分析純。

    電子恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;SHZCD真空抽濾機 鞏義市予華儀器有限責任公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;AN0837電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;TP3102分析天平 余姚倫銘稱重校驗設(shè)備有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 海帶多糖提取工藝

    1.2.1.1 傳統(tǒng)提取工藝[19]

    工藝流程:海帶→浸泡除雜→堿溶消化→減壓抽濾→濾液酸凝過夜→中和→醇析→減壓抽濾→沉淀物→烘干→粗多糖制品。

    操作要點:稱取1g洗凈的干燥海帶,然后加入2%碳酸鈉溶液40mL,于55℃消化2.0h;減壓抽濾,取濾液,用5%鹽酸使海帶多糖以膠態(tài)析出,靜置過夜,向靜置液中緩緩加入稀鹽酸,調(diào)pH1~2后過濾;在常溫下,邊攪拌邊加入2%碳酸鈉溶液溶解膠塊,至pH7.5中和完成;向中和后的溶液中加入一定量的無水乙醇析出沉淀;過濾,沉淀物于40~50℃烘箱中干燥,即得海帶多糖。

    1.2.1.2 酶法提取工藝

    工藝流程:海帶→浸泡除雜→酶解→滅酶→堿溶消化→減壓抽濾→濾液酸凝過夜→中和→醇析→減壓抽濾→沉淀物→烘干→粗多糖制品。

    操作要點:稱取1g洗凈的干燥海帶,按1:50(g/mL)的料液比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和一定體積分數(shù)的酶,在一定溫度和pH值下酶解一定時間,升溫滅酶;剩余操作同1.2.1.1節(jié)中操作要點。

    1.2.2 多糖測定

    采用干質(zhì)量法計算粗多糖的質(zhì)量,苯酚-硫酸法檢測多糖含量,確定多糖純度[20]。

    1.2.3 單因素試驗

    選用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及木聚糖酶4種酶,在酶各自的適宜條件下對海帶進行水解,分別考慮各單酶的最適提取條件。

    1.2.4 多糖提取的正交試驗

    以單因素酶解試驗為基礎(chǔ)進行正交試驗L8(27),確定復合酶法提取海帶多糖的最佳條件,優(yōu)化提取工藝。

    1.2.5 統(tǒng)計分析

    采用方差法進行結(jié)果分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 傳統(tǒng)提取工藝結(jié)果

    按照“1.2.1.1 傳統(tǒng)提取工藝”中操作要點進行3次平行實驗,得到傳統(tǒng)工藝海帶多糖的平均提取率為21.6%,其多糖含量平均值為49.81%。

    2.2 單因素試驗

    2.2.1 最適酶解pH值的確定

    分別考察了木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶在不同pH值,加酶量均為0.5%、50℃酶解3.0h、2%碳酸鈉溶液40mL于55℃消化2.0h的提取效果,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 pH值對多糖得率的影響

    十八大報告明確指出:“加大非公有制經(jīng)濟組織、社會組織黨建工作力度”“擴大黨組織和黨的工作覆蓋面”“創(chuàng)新基層黨建工作,夯實黨執(zhí)政的組織基礎(chǔ)”。因此,正確把握新形勢下非公有制經(jīng)濟組織黨組織建設(shè)現(xiàn)狀,分析其面臨的新情況新特點,及時跟進黨組織設(shè)置,加大在非公有制經(jīng)濟組織中黨建工作的力度,仍然是當前各級黨委面臨的重要課題。

    Fig.1 Effect of pH on the yield of polysaccharides

    由圖1可知,4種酶均在弱酸性條件下有較好的酶解效果,最適pH值分別為6.0、6.0、5.0、6.0。

    2.2.2 最適酶解時間的確定

    保持其他條件不變,分別考察木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶在不同酶解時間下,pH值分別為6.0、6.0、5.0、6.0的多糖提取結(jié)果,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 酶解時間對多糖得率的影響

    Fig.2 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

    由圖2可知,隨著酶解時間的延長,粗多糖的得率也不斷上升。至3h木聚糖酶處理的粗多糖得率達最大值。此后粗多糖得率隨著時間的延長平緩或急劇下降(纖維素酶),以木聚糖酶下降最為明顯。因此確定最佳酶解時間為3h。

    2.2.3 最適酶解溫度的確定

    圖3 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides

    由圖3可知,隨著溫度的增加,木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶的作用效果為先升高后下降,且分別在50、60、60℃時達到最大值。纖維素酶作用效果隨溫度升高呈遞減趨勢,在30℃時的多糖得率最高,因而在其酶促反應的適宜溫度應在30℃或更低。

    2.2.4 最適加酶量的確定

    木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分別在pH值為6.0、6.0、5.0、6.0,酶解時間均為3h,溫度分別為50、60、60、30℃,其他條件不變,在不同加酶量(質(zhì)量分數(shù))的條件下多糖的提取結(jié)果,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 加酶量對多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharides

    由圖4可知,隨著酶量的增加,多糖提取量均明顯增加,且在添加量達到0.5%后粗多糖得率上升的很緩慢(木瓜蛋白酶)甚至下降。因此,確定4種酶的最適加酶量均為0.5%。

    2.3 正交試驗

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,為了優(yōu)化提取工藝,選取纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、溫度、時間、pH值7個因素對多糖提取影響較大的因素,設(shè)計L8(27)正交表進行正交試驗。

    表1 復合酶法提取海帶多糖正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

    表2 正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

    如表1、2所示,通過方差分析,各因素對試驗指標影響的主次順序依次為:C、F、A、D、B、G、E。其中,C和F因素影響比較顯著,其最優(yōu)水平分別為C2和F1。對于其他因素,其最優(yōu)水平分別為:A1、B2、D2、E2、G1,但由于均為非顯著因素,考慮到原輔料成分及能耗等因素,選取水平分別為:A1、B2、D2、E1、G1。綜合以上,確定復合酶法提取海帶多糖的最佳工藝條件為:A1B2C2D2E1F1G1,即纖維素酶0.5%、木瓜蛋白酶1.0%、果膠酶1.0%、木聚糖酶1.0%、溫度30℃、酶解時間3h、pH5.0,在此條件下多糖的提取率為78.9%。采用苯酚-硫酸法測定粗多糖中多糖含量,得其純度為51.26%。

    3 結(jié) 論

    單因素試驗中,pH值方面,木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶均在弱酸性條件下有較好的酶解效果,最適pH分別為6.0、6.0、5.0、6.0。這是由于在最適pH值時,酶分子上活性基團的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合,而過酸或者過堿條件下,酶的空間結(jié)構(gòu)受到了破壞,影響了與底物的結(jié)合,從而使多糖的提取率下降[21];酶解時間方面,隨著酶解時間的延長,粗多糖的得率也不斷上升。至3h木聚糖酶處理的粗多糖得率達最大值。此后粗多糖得率隨著時間的延長平緩或(纖維素酶)急劇下降,以木聚糖酶下降最為明顯。這可能是因為酶解時間過長,多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或降解,從而使多糖的提取率下降[22],因此確定4種酶的最適酶解時間均為3h。

    海帶細胞壁主要由多糖和蛋白質(zhì)組成。纖維素酶水解纖維素,使細胞壁破裂;果膠酶通過對果膠質(zhì)的解酯、水解、破裂作用,促進多糖從細胞中釋放到提取液中;而木聚糖酶和木瓜蛋白酶加速了細胞組織的崩解,提高了纖維素酶和果膠酶的作用效果。4種酶相互作用,使其結(jié)果高于單一酶作用效果,顯著提高了海帶多糖的提取率。

    傳統(tǒng)工藝從海帶中提取海帶多糖的提取率為21.6%,而復合酶法的提取率為78.9%,海帶多糖產(chǎn)率較傳統(tǒng)工藝提高了近3倍,而且多糖純度相當。與傳統(tǒng)工藝相比,加入了相當于原料質(zhì)量0.5%~1.0%的酶,成本僅相當于新增產(chǎn)出的1/4,具有一定的經(jīng)濟效益。為復合酶在海帶多糖提取工藝的應用提供了可能性。

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    Optimization of Multi-Enzyme Hydrolysis ofLaminaria japonicafor Polysaccharide Extraction

    ZHAI Wei1,ZHANG Mei-shuang1,ZHANG Li-xia1,ZHAO Yan1,*,WU Peng2,ZHANG Lian-xue1,*
    (1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;2. Jiujiang Starlink Biotech Co. Ltd., Jiujiang 332000, China)

    This study was designed to optimize the extraction of polysaccharides fromLaminaria japonicaby one-step hydrolysis with four different enzymes. By using orthogonal array design and analysis of variance based on one-factor-at-atime experiments, the optimal hydrolysis conditions for polysaccharide extraction fromLaminaria japonicawere 0.5% cellulase,1.0% pectinex, 1.0% papain, 1.0% xylanase, extraction temperature of 30 ℃, extraction time of 3 h and pH 5.0. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides was 78.9%, which was increased approximately 3-fold compared with that obtained by the traditional extraction method.

    Laminaria japonica;multiple enzymes;polysaccharide

    TS201.1

    A

    1002-6630(2012)18-0006-04

    2011-08-25

    “十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B01);國家自然科學基金面上項目(31070316)

    翟為(1987—),女,碩士研究生,研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。E-mail:zhw2010062@163.com

    *通信作者:趙巖(1979—),男,副教授,博士,研究方向為中藥新藥研究與開發(fā)。E-mail:zhyjlu79@163.com張連學(1955—),男,教授,博士,研究方向為藥用植物。E-mail:zlx863@163.com

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