白蟻鏈霉菌ACT-2菌株抗菌譜及其發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性分析＊

宋迤明， 張曉陽， 董夏夢， 韋 鳳，藍麗精， 蔡琪敏， 蔣冬花

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2.金華市環(huán)境檢測中心，浙江 金華321013)

白蟻鏈霉菌ACT-2菌株抗菌譜及其發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性分析＊

宋迤明1， 張曉陽2， 董夏夢1， 韋 鳳1，藍麗精1， 蔡琪敏1， 蔣冬花1

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2.金華市環(huán)境檢測中心，浙江 金華321013)

測定了白蟻鏈霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株的抗菌譜.結果表明：ACT-2菌株對細菌類病原體有較強的拮抗能力，對真菌類病原菌抑菌效果不顯著.以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小種為指示菌，分析了ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性.ACT-2菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性實驗顯示：在溫度低于80℃，4 000 lx光照強度下，ACT-2菌株發(fā)酵液能保持穩(wěn)定的抑菌能力;溫度高于90℃時，其發(fā)酵液的抑菌能力開始降低;經酸堿處理后，其發(fā)酵液的抑菌能力出現(xiàn)了明顯的降低.

白蟻鏈霉菌;白葉枯病;抗菌譜;穩(wěn)定性

放線菌，尤其鏈霉菌，廣泛存在于土壤環(huán)境中，并大范圍應用于抗生素的生產［1］.鏈霉菌菌株可產生約6 550種抗生素類物質，約占由放線菌產生抗生素總量的70%［2-3］.這些抗生素類物質屬于鏈霉菌的次級代謝產物，可以在自然環(huán)境中發(fā)生降解［4］，且可以特異性地作用于某些病原菌，降低由該病原菌所致病害的發(fā)病率.因此，這類鏈霉菌可作為生防菌，應用于農業(yè)生產中［5］.

白蟻鏈霉菌ACT-2菌株篩選自金華市郊區(qū)水稻試驗田土壤中，通過打孔法和牛津杯法實驗，表明該菌對水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6的生長和繁殖具有較強的抑制作用.本研究對ACT-2菌株的抗菌譜及其發(fā)酵液抑菌能力的穩(wěn)定性進行了探討，為該生防菌株的應用和發(fā)酵液中有效組分的分離純化、加工儲藏提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小種，由浙江師范大學化學與生命科學學院遺傳實驗室提供;白蟻鏈霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株，分離自浙江省金華市郊區(qū)水稻試驗田;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium semitectum)、番茄早疫病菌(Alternaria sonali)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、楊樹潰瘍病菌(Botryosphaeria dothidea)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)由本實驗室保存.

1.2 發(fā)酵液的制備

從固體培養(yǎng)基白蟻鏈霉菌ACT-2菌落上刮取少量的孢子，接入裝有高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中(裝液量為50 mL，pH 7.2 ～ 7.5)，180 r/min 28℃搖床培養(yǎng)36 h，作為種子液.取100 μL種子培養(yǎng)液，以0.2%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL搖瓶裝液量為50 mL，發(fā)酵液初始pH調至7.5，搖床轉速為180 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)72 h.發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液置于50 mL離心管中10 000 r/min離心10 min，上清液通過孔徑為0.22 μm細菌過濾膜過濾，重復2次，除去殘余孢子.

1.3 抗菌譜的測定

1.3.1 “十”字交叉法

參見文獻［6］.將上述上清液與融化的PDA固體培養(yǎng)基以1∶9的體積比混合均勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成帶藥平板.用打孔法移取直徑5 mm帶有待測病原菌的菌餅到凝固后的培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)72 h，用“十”字交叉法測量供試病原菌菌落的生長直徑，并計算菌絲生長抑制率.設置3組平行測定，取平均值.

1.3.2 牛津杯法

參見文獻［7］.在無菌的培養(yǎng)皿內加入20 mL培養(yǎng)基，凝固后將病原菌培養(yǎng)液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，在中心放置1個滅菌的牛津杯，每個牛津杯中加入200 μL白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液，將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測定抑菌圈的直徑.每個處理重復3次，取平均值.

1.4 ACT-2菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的分析

1.4.1 熱穩(wěn)定性

將白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵濾液分別置于 50，60，70，80 和90 ℃條件下處理2 h.

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性

分別用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液將ACT-2菌株發(fā)酵濾液pH標定至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 和 10.0，處理 2 h，再將發(fā)酵濾液調回其原始pH 7.8.

1.4.3 光穩(wěn)定性

將ACT-2菌株發(fā)酵濾液置于光強度為4 000 lx 的光源下，分別照射3，6，9，12，15 和18 h.

以ACT-2菌株原始發(fā)酵濾液為對照，以水稻白葉枯病菌P6生理小種作為指示菌，用牛津杯法測定上述經熱、酸堿或光照處理發(fā)酵濾液的抑菌率，重復3次.

2 結果與分析

2.1 ACT-2菌株發(fā)酵液的抗菌譜

由表1可知，ACT-2菌株發(fā)酵液對真菌類病原菌具有一定的抑制作用，但是抑菌作用較弱.在所選測試的9種植物病原真菌中，對黃瓜枯萎病菌的抑制作用最強，抑菌率達40.91%;對稻曲病菌的抑制作用最弱，抑菌率為28.73%.

表1 白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液對植物病原真菌的抑菌率

表2反映了ACT-2菌株發(fā)酵液對病原細菌的抑制能力.通過牛津杯法測試，ACT-2菌株發(fā)酵液對所選4種病原細菌的抑菌圈直徑均達到20.00 mm以上，抑菌效果比較好.

表2 白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液對病原細菌的抑菌作用

2.2 ACT-2菌株發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

圖1 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同溫度處理后對白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

由圖1可知：溫度為50～70℃時，ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性與對照相近;當溫度升高到80℃時，發(fā)酵液的抑菌活性略有下降;當溫度升高到90℃時，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為22.00 mm，比對照組(抑菌圈直徑為24.83 mm)的抑菌活性有較顯著的下降.表明ACT-2菌株發(fā)酵液在溫度低于80℃環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性，但溫度高于90℃則可能對發(fā)酵液中的活性物質造成一定的破壞.

2.3 ACT-2菌株發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

由圖2可知：ACT-2菌株發(fā)酵液在pH 2.0，3.0，4.0，5.0 和 6.0 環(huán)境下處理2 h 后，發(fā)酵液的抑菌能力均有一定程度的下降，抑菌圈直徑隨pH值的降低而減小，在pH 2.0時抑菌圈直徑最小，為17.56 mm;當 pH 在9.0 ～10.0 時，抑菌圈直徑隨著pH值的增大而減小，而且堿性越強抑菌圈直徑減小得越多，在 pH 9.0時抑菌圈直徑為22.56 mm，在 pH 10.0 時抑菌圈直徑為 21.11 mm.ACT-2菌株發(fā)酵液在 pH 7.0～8.0時抑菌圈直徑沒有顯著差異.表明ACT-2菌株發(fā)酵液活性物質的抑菌能力受酸堿度影響較大，但是由于在pH 2.0和pH 10.0時仍具有一定的抑菌活性，說明該活性物質對酸堿環(huán)境仍具有一定的耐受性.

圖2 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同酸堿環(huán)境處理后對白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

圖3 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同時間光照處理后對白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

2.4 ACT-2菌株發(fā)酵液的光穩(wěn)定性

由圖3可知，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液于28 ℃下用 4 000 lx光照處理 3，6，9，12，15 和18 h后，發(fā)酵液的抑菌能力沒有顯著差異.表明ACT-2菌株發(fā)酵液中的抑菌物質對光較穩(wěn)定.

3 討論

研究結果表明，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株對多種導致植物病害的病原菌均有一定程度的抑制作用，尤其是對細菌類病原菌的作用效果更明顯.國內有一些有關放線菌抑菌作用的相關報道，如邵彥坡等［8］發(fā)現(xiàn)的海洋放線菌B5菌株和張玲玲等［9］發(fā)現(xiàn)的土壤放線菌C3-1菌株等，對真菌類病原菌表現(xiàn)出比較強烈的抑制作用.與這些報道不同的是，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株篩選自金華市郊外水稻試驗田，對細菌類病原菌表現(xiàn)出較強的拮抗作用.因此，開發(fā)利用白蟻鏈霉菌ACT-2菌株防治水稻白葉枯病菌具有較好的前景.

嵇豪等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，生物活性物質的加工和儲藏容易受到該物質穩(wěn)定性的影響;汪茜等［11］認為生物活性物質能否發(fā)揮有效作用與其自身的穩(wěn)定性有密切關系.通過對白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的研究，表明該菌株發(fā)酵液對光照和溫度表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，可以耐受一定程度的高溫;對酸堿度的耐受性稍差一些，本研究數據顯示，ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性下降幅度并不明顯，穩(wěn)定性較高.這使該菌株發(fā)酵液的生防應用，以及其中有效組分的分離純化和加工儲藏成為可能.

［1］Merav K，Marianna O，Ilan C h，et al.Soil-borne strain IC14 of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases［J］.Soil Biol Biochem，2003，35：323-331.

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［5］Paulitz T C，Belanger R R.Biological control in greenhouse systems［J］.Annu Rev Phytopathol，2001，39：103-133.

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［7］劉冬梅，李理，楊曉泉.用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(3)：110-111.

［8］邵彥坡，方麗萍，魏少鵬，等.海洋放線菌B5菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性研究［J］.西北農業(yè)學報，2007，16(3)：248-251;256.

［9］張玲玲，董美玉，許鳳春，等.放線菌C3-11的抗菌活性篩選及發(fā)酵液穩(wěn)定性研究［J］.現(xiàn)代農業(yè)科技，2009(3)：109-113.

［10］嵇豪，蔣冬花，楊葉，等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅曲米中水溶性色素［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2011，34(1)：91-96.

［11］汪茜，胡春錦，柯仿鋼，等.生防菌株1404的鑒定及其對采后柑橘炭疽病的防治效果［J］.微生物學報，2010，50(9)：1208-1217.

Antimicrobial spectrum of Streptomyces termitum strain ACT-2 and antibacterial stability of its fermentation broth

SONG Yiming1， ZHANG Xiaoyang2， DONG Xiameng1， WEI Feng1，LAN Lijing1， CAI Qimin1， JIANG Donghua1

(1.College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Environmental Monitoring Center of Jinhua，Jinhua Zhejiang 321013，China)

The results of bacteriostasis experiments demonstrated that strain ACT-2 suppressed a wide range of bacterial pathogens in vitro，while no obvious antimicrobial activities towards fungal pathogens.Antibacterial stability of Streptomyces termitum strain ACT-2 fermentation broth was studied while Xanthomonas oryzae pv.oryzae physiological strain P6 was chosen as indicator bacteria.The fermentation broth could show obvious bacteriostatic activity when the tempreture was below 80℃or exposured in the 4 000 lx illuminant;the diameter of inhibition zone decreased when the tempreture came up to 90℃.The fermentation broth was sensitive to acidity and alkalinity，the activity decreased after treatment.

Streptomyces termitum;bacterial leaf blight;antimicrobial spectrum;stability

Q939.92

A

2012-02-14

浙江省公益性技術應用研究計劃項目(2010C32076)

宋迤明(1986－)，男，山東梁山人，碩士研究生.研究方向：應用微生物學.

蔣冬花.E-mail：jdh@zjnu.cn

(責任編輯 薛 榮)