順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡作用及其對(duì)線粒體膜電位變化的研究

蔡先彬 胡輝 王欽加 荊緒斌

·論著·

順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡作用及其對(duì)線粒體膜電位變化的研究

蔡先彬 胡輝 王欽加 荊緒斌

目的 研究線粒體膜電位在順鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法 采用MTT比色法測(cè)定順鉑對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的生長抑制曲線;將胃癌SGC7901細(xì)胞分成對(duì)照組及10 μg/ml順鉑組處理，用流式細(xì)胞儀(FCS)分別檢測(cè)線粒體膜電位(Δψm)和分析細(xì)胞周期變化情況。結(jié)果 順鉑可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖。在24 h后可見細(xì)胞大部分受阻于G1期，且出現(xiàn)了典型的凋亡峰;在10 h后線粒體膜電位明顯降低。結(jié)論 順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的途徑可能是通過使線粒體膜通透性的改變，膜電位的下降來而實(shí)現(xiàn)的。

線粒體膜電位;凋亡;胃癌;順鉑

順鉑是腫瘤化療的常用藥物。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，順鉑能夠引起細(xì)胞DNA交聯(lián)，起腫瘤細(xì)胞毒性作用。近年隨著分子生物學(xué)發(fā)展，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)順鉑抗癌機(jī)制與腫瘤細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)順鉑可通過Fas死亡受體途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3，4］，而線粒體被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要途徑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)順鉑可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，且是通過線粒體途徑引發(fā)一系列凋亡程序來實(shí)現(xiàn)［5］。目前，順鉑作為胃癌臨床常用化療藥物之一，其是否存在此類機(jī)制，相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少。為此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)來探討在順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中線粒體變化情況，從而了解線粒體與胃癌細(xì)胞凋亡之間關(guān)系。這對(duì)于研究細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義，同時(shí)為臨床腫瘤化療用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑 順鉑、噻唑藍(lán)(MTT)、過氧化氫酶(CAT)、碘化丙啶(PI)和RNA酶購于Sigma公司;1640培養(yǎng)基購于Gibco公司;3，3'-Dihexyloracarbocyanine(DiOC6(3))分子探針購于美國Calbiochem公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人的胃癌細(xì)胞系SGC-7901被培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清(FCS;Gibco)、100/ml青霉素(Gibco)和100 g/ml鏈霉素(Gibco)的RPMI1640的培養(yǎng)液中;培養(yǎng)條件為，37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中孵育。選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加不同濃度的藥物作用一定時(shí)間后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)均分對(duì)照組(溶劑對(duì)照)和實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長抑制率 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μl每孔)24 h后棄上清，加入不同濃度的順鉑稀釋液(0，1，5，10，15 μg/ml，100 μl每孔)。培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液(5 mg/ml，50 μl每孔)繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，加入150 μl DMSO，振蕩溶解10 min?？瞻讓?duì)照調(diào)零，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值(A值)，按以下公式求生長抑制率。生長抑制率(%)= (1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。計(jì)算IC50，作為用于檢測(cè)線粒體膜電位及細(xì)胞周期時(shí)處理細(xì)胞的順鉑濃度。同時(shí)觀察細(xì)胞用藥前后生長情況并使用倒置相差顯微鏡拍照。

1.4 細(xì)胞周期分析及凋亡率的檢測(cè) 將10 μg/ml順鉑處理24 h后的SGC-7901細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗2次，體積百分比為70%乙醇固定，4℃過夜。上機(jī)前收集離心細(xì)胞，PBS洗3次后用0.5 mg/ml RNase酶37℃作用1 h，50 μg/ml的PI染色30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Δψm的測(cè)定 DiOC6(3)是一種特異性膜電位標(biāo)記的熒光染料，對(duì)膜具有通透性，其熒光信號(hào)主要集中于線粒體，其熒光強(qiáng)度的變化反映了Δψm的變化［6］。將10 μg/ml順鉑處理10 h后的SGC-7901細(xì)胞用胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，細(xì)胞重懸于500 μl PBS中，加入DiOC6(3)染液，避光染色30 min后用FACS檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 順鉑抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞生長，圖1表明，對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后，導(dǎo)致細(xì)胞生長明顯受到抑制，順鉑對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率呈濃度依賴關(guān)系。經(jīng)過計(jì)算可求得線性回歸方程y=4.732x+2.050，經(jīng)計(jì)算IC50為10.13 μg/ml，約為10 μg/ml。

圖1 順鉑的濃度-生長抑制曲線

圖2表明體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁生長，狀態(tài)良好。但在加入10 μg/ml濃度的順鉑處理后，細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮，偽足形成，細(xì)胞折光性差，模糊，隨著劑量增加或時(shí)間延長甚至可見細(xì)胞呈“發(fā)芽”狀改變，類似凋亡細(xì)胞形態(tài)改變，最終漂浮起來。但如果給予大劑量順鉑與細(xì)胞一起培養(yǎng)，我們可以看到大量細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)縮小、脫落、漂浮，生產(chǎn)許多細(xì)胞碎片，可能形成細(xì)胞壞死。

2.2 FCS檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率 表1顯示順鉑作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞后，其細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生顯著變化，細(xì)胞大部分受阻于G1期，DNA合成下降，且出現(xiàn)了典型的凋亡峰。G1期:對(duì)照組為(51.36±2.59)%，順鉑組24 h后平均為(41.02±3.67)%;G2期:對(duì)照組為(33.53±1.79)%，順鉑組為(16.46±3.12)%;凋亡率:對(duì)照組為(2.31± 0.56)%，順鉑組為(30.26±2.21)%，兩組比較差異有非常顯著性。

圖2 細(xì)胞生長48 h后已經(jīng)生長至少融合約90%，生長良好，細(xì)胞緊密連接，可見細(xì)胞核在分裂增殖。

圖3 DDP作用細(xì)胞24 h后形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變圓，細(xì)胞連接松散，細(xì)胞核裂解。

表1 不同處理組對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞周期和凋亡率的影響(±s，%)

表1 不同處理組對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞周期和凋亡率的影響(±s，%)

注:與對(duì)照組比較*P＜0.01

組別 例數(shù) G0/G1 S G2/M 凋亡率對(duì)照組 6 51.36±2.59 12.11±3.31 33.53±1.79 2.31±0.56順鉑組 6 41.02±3.67 11.52±2.26 16.46±3.12* 30.26±2.21*

2.3 FCS檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞Δψm改變的結(jié)果 線粒體是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，用DiOC6(3)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)FCS檢測(cè)，可按一定標(biāo)尺分成兩群細(xì)胞:熒光強(qiáng)度低(Δψmlow)的細(xì)胞和熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞(Δψmhing)。順鉑處理過的胃癌SGC-7901細(xì)胞用FACS檢測(cè)Δψm時(shí)，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞明顯減少，由對(duì)照組的(94.51± 2.10)%下降至(59.54±3.25)%，即線粒體膜電位明顯下降(圖4)，P＜0.01。

圖4

3 討論

細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞最基本的生命過程之一，本質(zhì)上是一種編程性細(xì)胞死亡。研究表明［7］，在腫瘤組織中普遍存在細(xì)胞凋亡，它與腫瘤發(fā)生、發(fā)展與退化密切相關(guān)，現(xiàn)已明確大多數(shù)抗腫瘤藥物都能誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過MTT比色分析法觀察到，順鉑對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有很強(qiáng)的抑制作用。細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生物化學(xué)特征就是DNA的片段化。這是由于內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶活化降解DNA，使細(xì)胞DNA含量及細(xì)胞周期時(shí)相分布發(fā)生改變。將SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過藥物處理之后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)該藥能夠引起明顯的細(xì)胞周期阻滯，G1期細(xì)胞顯著增多，在正常的G0/G1峰之前出現(xiàn)特異的亞二倍體峰，其峰值為(30.26±2.21)%，明顯高于腫瘤細(xì)胞的自發(fā)凋亡。

近年研究表明，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中既是引發(fā)器，也是信號(hào)放大器，是細(xì)胞凋亡過程中的中心環(huán)節(jié)［8］。線粒體跨膜電位(Δψm)與線粒體通透性改變?cè)诩?xì)胞凋亡過程中起著重要作用，而Δψm下降是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的較早事件，而一旦線粒體Δψm耗散，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過程。在細(xì)胞凋亡過程中線粒體Δψm耗散主要是由于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(-040)調(diào)節(jié)。-040關(guān)閉能防止細(xì)胞凋亡;在-040開放時(shí)線粒體釋放細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，造成線粒體膜電位和生物合成破壞，細(xì)胞的能量代謝受損，氧化呼吸鏈解偶聯(lián)，基質(zhì)滲透壓升高，線粒體體積擴(kuò)大，外膜破裂可溶性膜間蛋白，包括cytoC釋放，激發(fā)胞質(zhì)半胱氨酸蛋白酶的連鎖反應(yīng)，從而激活核酸內(nèi)切酶蛋白酶，從而啟動(dòng)了凋亡［9］。因此能夠引起線粒體誘導(dǎo)MPTP開放的物質(zhì)，都有可能引起細(xì)胞凋亡。為了更進(jìn)一步了解順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中線粒體變化情況，本研究利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體跨膜電位。結(jié)果顯示CDDP作用12 h后細(xì)胞內(nèi)的Δψm明顯下降。

因此我們認(rèn)為，順鉑可能是通過使胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體膜上的MPTP開放，線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子造成的線粒體膜電位和生物合成的破壞，而促進(jìn)凋亡。這闡明了順鉑在抗腫瘤過程中，參與了線粒體調(diào)控，破壞線粒體功能，達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長，為腫瘤化療治療提供一定的理論依據(jù)。

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The study on mitochondrial transmembrane potential variation and apoptosis in gastric carcinoma SGC-7901 cell line induced by the cisplatin

CAI Xian-bin，HU Hui，WANG Qin-jia，et al．Department of Gastroen-terology，The First Affiliated Hospital，Shantou university，Medical College，Shantou 515041，China

ObjectiveTo study the role of mitochondrial transmembrane potential in the cisplatin-induced apoptosis of the gastric carcinoma SGC-7901 cell lines.MethodsMTT assay was used to evaluate the influence of cisplatin on proliferation of cells.The SGC-7901 cells were treated by 0，10 μg/ml cisplatin.Flow cytometry was used to test the hypodiploid and intracellular mitochondrial transmembrane potential(Δψm)in cells.ResultsThe cisplatin could suppress proliferation of SGC-7901 cell lines.Δψm decreased evidently after treated by cisplatin for 10 hours.Most SGC-7901 cells were held in G1 period and a Sub-G1 peak(apoptosis peak)could be observed after the addition of the cisplatin for 24 hours.ConclusionThe cisplatin may disable mitochondrial biological function and decreased Δψm，which led to apoptosis of gastric carcinoma cells．

Mitochondrial transmembrane potential;Apoptosis;Gastric carcinoma;Cisplatin

515041汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

蔡先彬 E-mail:cxbin1@qq.com