田口設計優(yōu)化耶氏酵母生產(chǎn)γ-癸內酯

趙玉萍，徐 巖，朱 春

（1.江南大學生物工程學院釀造科學與酶技術中心，教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安 223003）

田口設計優(yōu)化耶氏酵母生產(chǎn)γ-癸內酯

趙玉萍1，2，徐 巖1，*，朱 春2

（1.江南大學生物工程學院釀造科學與酶技術中心，教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安 223003）

通過田口設計對產(chǎn)γ-癸內酯的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。根據(jù)單因素實驗結果，利用Minitab軟件設計正交實驗，采用田口設計方法分析正交實驗中各因素水平的均值情況和信噪比情況。實驗結果表明，復合氮源即酵母膏和（NH4）2HPO4對γ-癸內酯產(chǎn)量影響極顯著，MgSO4·7H2O對γ-癸內酯產(chǎn)量影響顯著。軟件預測培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為麩皮20g/L、酵母膏7.5g/L、（NH4）2HPO416.5g/L、KH2PO46g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，預測產(chǎn)量為2.49g/L，信噪比為9.04dB，經(jīng)驗證γ-癸內酯產(chǎn)量為2.65g/L，信噪比為9.68dB，優(yōu)化方案達到了預期效果，具有較好的穩(wěn)定性。

γ-癸內酯，耶氏酵母，田口設計，優(yōu)化

γ-癸內酯（γ-decalactone，GDL）是一種含有五元內酯環(huán)的十碳化合物，天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，也存在于乳制品的風味物質中，具有強烈的果香香氣，稀釋時有桃子香氣[1-4]。1969年，GDL被美國有關食品組織認為是安全的食品添加劑和藥物添加劑[4]。γ-癸內酯是手性分子，從水果中提取的γ-癸內酯具有特定的立體結構，而化學法生產(chǎn)的卻是消旋體，因此，用生物法生產(chǎn)光活性γ-癸內酯的工作吸引了許多研究人員的關注[5-8]。Rabenhorst等[9]利用解脂酵母HR 145發(fā)酵生產(chǎn)γ-癸內酯，產(chǎn)量達11.5～ 12.5g/L。徐勤等[10]采用紫外誘變畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)γ-癸內酯，產(chǎn)量達1.25g/L。田口設計又可稱為田口方法（Taguchi Method），20世紀50年代初，日本電訊研究所中，以田口玄一為首的一批研究人員在費歇爾多元配制法實驗設計基礎上開發(fā)了正交實驗技術，并利用一套規(guī)范化正交表安排實驗。該方法將質量管理與經(jīng)濟效益聯(lián)系在一起，將工程經(jīng)驗與統(tǒng)計原理相結合，運用數(shù)學方法，從工程觀點、技術觀點和經(jīng)濟觀點對質量管理的理論和方法進行綜合研究，從而形成了一套獨具特色的、有效性、通用性、邊緣性極強的質量穩(wěn)健性設計方法[11]。Yun Teng[12]等運用田口方法對全細胞脂肪酶生產(chǎn)研究的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，通過實驗證明，該方法高效、穩(wěn)健。本文擬采用田口設計的方法優(yōu)化生產(chǎn)γ-癸內酯的營養(yǎng)性條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 實驗室篩選，經(jīng)誘變和定向選育技術獲得的耶氏酵母（Yarrowia sp.CGMCC 2.1405）；種子培養(yǎng)基 參考文獻[13]；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖15g/L，酵母膏3g/L，（NH4）2HPO413g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，蓖麻油5%，吐溫-80 0.2%，pH7.5，用250m L三角瓶，每瓶分裝30m L，106℃滅菌20m in備用。

BCM－1000超凈工作臺 上海和呈儀器制造有限公司；QYC－211恒溫搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；6820氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)及發(fā)酵條件 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量均為30m L/250m L三角瓶，種子培養(yǎng)和發(fā)酵條件均為：溫度30℃，搖床轉速150r/m in。將斜面種子接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，作為一級種子。將一級種子按5%的接種量接入種子培養(yǎng)基，按上述條件培養(yǎng)，作為二級種子。將二級種子按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)基中加入5%已滅菌的蓖麻油。將三角瓶放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)至48h后，檢測GDL的產(chǎn)量。

1.2.2 碳源、氮源、無機鹽、磷酸鹽及表面活性劑的選擇 采用單因素實驗方法，只改變其中一種營養(yǎng)條件，添加量均同發(fā)酵培養(yǎng)基的添加量。碳源有葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、玉米粉和薯干粉。以牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作為有機氮源，確定最佳有機氮源后，研究有機氮源與無機氮源（NH4）2HPO4的比例關系，實驗條件分別為1∶5、3∶3、5∶1、7∶9、9∶7、11∶5、13∶3和15∶1，總氮源添加量為16g/L。無機鹽分別選擇NaCl、MgSO4·7H2O和CuSO4·5H2O。以KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4作為磷酸鹽研究對象。

1.2.3 田口設計優(yōu)化培養(yǎng)基 將發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽及磷酸鹽這幾個因素水平綜合在一起，利用M initab 15軟件進行田口實驗方案設計，根據(jù)設計出的實驗方案實施實驗，利用此軟件對實驗結果進行分析，得出優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方。利用Minitab 15軟件可以預測出在優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方下能夠得到的產(chǎn)物產(chǎn)量及信噪比。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進行驗證實驗，將實驗得到的實際值與預測值進行比較，評價優(yōu)化方案。

1.2.4 樣品處理及γ－癸內酯定量測定方法 發(fā)酵液離心去除菌體，上清液酸化至pH2，乙酸乙酯室溫萃取，吸取一定量上層有機相加內標物壬內酯后通過氣相色譜進行檢測（工作條件：后進樣，280℃，采用毛細管柱，檢測器FID，300℃。程序升溫，初始溫度100℃，以10℃/m in升至250℃，保持10m in[13－14]）。γ－癸內酯氣相色譜圖見圖1；GDL產(chǎn)量計算見式（1）：

圖1 γ－癸內酯氣相色譜圖Fig.1 Gas Chromatogram ofγ－decalactone

2 結果與討論

2.1 碳源的選擇

選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、玉米粉和薯干粉作為碳源進行單因素實驗以GDL的產(chǎn)量作為考核指標，實驗結果如圖2所示。

圖2 不同碳源對GDL產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on GDL yield

通過圖2可以看出可溶性淀粉、麩皮、薯干粉對提高GDL的產(chǎn)量有較大的作用，其中以麩皮最為明顯，這可能是麩皮中含有較豐富的維生素類物質，對于耶氏酵母的代謝及β－氧化等過程可能具有微量元素等作用，因此有利于耶氏酵母代謝產(chǎn)物GDL的合成。

2.2 氮源的選擇

首先是對有機氮源的種類進行實驗，選擇牛肉膏、酵母膏和蛋白胨作為實驗對象，實驗結果如圖3所示。

圖3 不同的有機氮源對GDL產(chǎn)量的影響Fig.3 Effectof differentnitrogen sources on GDL yield

通過圖3可以看出，選用酵母膏作為有機氮源時，發(fā)酵產(chǎn)物GDL的產(chǎn)量明顯高于其他兩種氮源的值，因此確定酵母膏為最適有機氮源。

實驗進一步研究酵母膏與（NH4）2HPO4不同比例對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，通過圖4可以得出結論，當酵母膏與（NH4）2HPO4的比例為5∶11時最有利于提高GDL的產(chǎn)量。

圖4 氮源的不同比例對GDL產(chǎn)量的影響Fig.4 Effectof different ratio of nitrogen sources on GDL yield

2.3 無機鹽的選擇

選用NaCl、MgSO4·7H2O和CuSO4·5H2O及其不同的水平進行實驗，實驗結果如表1所示。

表1 不同無機鹽及其水平對GDL產(chǎn)量的影響Table 1 Effectof different salts and levels on GDL yield

由表1可以看出，與對照組相比，銅離子的引入會對GDL的產(chǎn)生有抑制作用，降低產(chǎn)物產(chǎn)量。鈉離子與鎂離子對GDL的產(chǎn)生有促進作用，提高產(chǎn)物產(chǎn)量。鈉離子與鎂離子的作用相比較，當鎂離子的濃度為0.5g·L-1時，其對GDL的合成促進作用最明顯。

2.4 磷酸鹽的選擇

對于KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4這些不同磷酸鹽的實驗結果如圖5所示。

圖5 不同磷酸鹽對GDL產(chǎn)量的影響Fig.5 Effectof different phosphates on GDL yield

與對照組相比加入磷酸鹽可以促進產(chǎn)物GDL的合成，其中KH2PO4和NaH2PO4的作用最為明顯，其促進程度也幾乎相同。

2.5 田口設計優(yōu)化培養(yǎng)基

2.5.1 單因素實驗確定濃度 選定麩皮、復合氮源酵母膏＋（NH4）2HPO4、MgSO4·7H2O和KH2PO4作為進一步優(yōu)化的因素，為確定各因素范圍，采用單因素實驗方法，每次僅改變一個變量的濃度，其他條件均不改變，其他變量濃度按照均按照發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度，實驗結果如圖6～圖8所示。

圖6 麩皮濃度對GDL產(chǎn)量的影響Fig.6 Effectof differentwheatbran concentrations on GDL yield

圖7 復合氮源濃度對GDL產(chǎn)量的影響Fig.7 Effectof different composite nitrogen concentrations on GDL yield

圖8 磷酸二氫鉀濃度對GDL產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of different KH2PO4 concentrations on GDL yield

由圖6～圖8可以看出，麩皮、復合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）和KH2PO4對GDL產(chǎn)量有一定的影響，為進一步優(yōu)化培養(yǎng)基中各組分的濃度，采用田口設計法作深入研究。2.5.2 田口設計實驗結果 綜合以上單因素實驗的結果，選定麩皮、復合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）、MgSO4·7H2O和KH2PO4作為進一步優(yōu)化的因素，確定三個水平，由圖6～圖8選定麩皮、復合氮源（酵母膏＋（NH4）2HPO4）和KH2PO4的水平范圍，由表1選定MgSO4·7H2O的水平范圍，所選擇的因素及因素水平如表2所示。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table

按照M initab 15設計的實驗方案實施實驗。發(fā)酵時的培養(yǎng)條件為搖床轉速150r/min，溫度為26℃。裝液量為30m L/250m L三角瓶，接種量為5%，蓖麻油接入量5%。選擇兩個搖床作為兩個噪聲因素進行研究，GDL產(chǎn)量分別用GDL-1和GDL-2表示。利用M initab 15軟件，依次選擇統(tǒng)計、DOE、田口，創(chuàng)建田口設計選項，在田口設計的對話框中選擇4因素3水平，利用軟件設計出一張有9組實驗的正交表，按此正交表配制成不同的培養(yǎng)基，進行實驗并將結果記錄于表3。

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal test results

運用Minitab 15軟件可以分析實驗結果的各因素水平的均值情況和信噪比情況，并且可以得到均值主效應圖和信噪比主效應圖，通過分析這些圖表可確定位置因子、散度因子和調整因子[20]，最終得到培養(yǎng)基最優(yōu)的因素水平組合。其均值主效應圖、信噪比主效應圖和均值響應表、信噪比響應表分別如圖9、圖10和表4、表5所示。

為了找出影響均值和信噪比的顯著性因素，對實驗結果進行了均值和信噪比的方差分析，分析結果見表6、表7。

圖9 均值主效應圖Fig.9 Themain effectmap ofmean value

圖10 信噪比主效應圖Fig.10 Themain effectmap of ratio of signal to noise

表4 所選因素水平的均值響應表Table 4 Mean value response table of selected factor levels

表5 所選因素水平的信噪比響應表Table 5 Ratio of signal to noise response table of selected factor levels

表6 均值方差分析Table 6 Analysis of variance ofmean value

表7 信噪比方差分析Table 7 Analysis of variance of ratio of signal to noise

對均值響應表和均值的方差分析表進行分析可知，對于均值而言因素B為極顯著因素，因素C為顯著因素。確定因素B、C和D為位置因子。

對信噪比響應表和信噪比的方差分析表分析可知，因素B為顯著因素。確定因素A、B和C為散度因子。

對于優(yōu)化培養(yǎng)基的選擇，根據(jù)均值和信噪比的主效應圖，首先選擇位置因子的水平使均值最大，即B3C2D2，再選擇非位置因子的散度因子A的第三水平，使散度最小化。最終得出最優(yōu)培養(yǎng)基的組合為A3B3C2D2，即麩皮20g/L、酵母膏7.5g/L、（NH4）2HPO416.5g/L、KH2PO46g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，由此可以看出當因素A、B是高水平時有利于GDL的產(chǎn)生。

信噪比是田口設計中作為衡量穩(wěn)健性的重要指標，信噪比的數(shù)值越大則穩(wěn)健性越好。利用Minitab 15預測出在此水平組合下的產(chǎn)量為2.49g/L，信噪比為9.04dB。

2.6 驗證實驗

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合配制培養(yǎng)基，進行驗證實驗，得到的驗證值為2.65g/L，信噪比為9.68dB，驗證值比較接近預測值，說明此優(yōu)化方案達到了預期的優(yōu)化效果，且具有較好的穩(wěn)定性。

3 結論

綜上所述，采用Yarrowia sp.CGMCC 2.1405發(fā)酵生產(chǎn)GDL，在單因素實驗的基礎上確定了最佳碳源、氮源、磷酸鹽和無機鹽，利用M initab軟件設計正交實驗，采用田口設計方法分析正交實驗中各因素水平的均值情況和信噪比情況，經(jīng)實驗分析，得出最優(yōu)培養(yǎng)基組合為：麩皮20g/L，酵母膏7.5g/L，（NH4）2HPO416.5g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用M initab 15預測出在此水平組合下的GDL產(chǎn)量為2.49g/L，信噪比為9.04dB。經(jīng)驗證實驗，獲得GDL產(chǎn)量為2.65g/L，信噪比為9.68dB，驗證值比較接近預測值，說明此優(yōu)化方案達到了預期的優(yōu)化效果，且具有較好的穩(wěn)定性。

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Optim ization of culture medium forγ-decalactone production by Yarrow ia sp.using Taguchidesign

ZHAO Yu-ping1，2，XU Yan1，*，ZHU Chun2
（1.Center of Brewing Science and Enzyme Technology，School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；
2.School of Life Science and Chemical Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003，China）

Culture medium forγ-decalacton p roduc tion by Yarrow ia sp.was op tim ized by using Taguchi design.First，sing le factor was tested，then orthogonal experiment was designed to carry out using Minitab software，and the result of the mean and SNR of level of each factor were analyzed by using Taguchi design. The result p roved that the effec t of com posite nitrogen was very significant，and（NH4）2HPO4was significant. Software p red icted the op timal culture medium consisted of 20g/L wheat b ran，7.5g/L yeast extrac t，16.5g/L（NH4）2HPO4，6g/L KH2PO4and 0.5g/LMgSO4·7H2O，and GDL yield was 2.49g/L，the SNR was 9.04dB.Theγdecalacton yield of verification experiment was 2.65g/L，and the SNR was 9.68dB.The result showed that the op timalsolution achieved the desired effectw ith good stability.

γ-decalactone；Yarrow ia sp.；Taguchidesign；med ium op tim ization

TS201.3

B

1002-0306（2012）20-0326-05

2012－05－24 *通訊聯(lián)系人

趙玉萍（1977-），女，博士研究生，副教授，研究方向：生物技術。

江蘇省科技支撐計劃（BE2012111）；淮安市工業(yè)科技計劃（HAG09040）。