杏鮑菇酶解液膜分離脫苦工藝的研究

熊文飛，陳日春，唐勝春，宋洪波

（1.福州市食品工業(yè)研究所，福建福州 350013；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002）

杏鮑菇酶解液膜分離脫苦工藝的研究

熊文飛1，2，陳日春1，唐勝春1，宋洪波2

（1.福州市食品工業(yè)研究所，福建福州 350013；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002）

研究膜分離技術對杏鮑菇酶解液的脫苦工藝。在單因素實驗的基礎上，采用響應面實驗設計優(yōu)化得到500u納濾膜分離脫苦的最優(yōu)條件為壓力0.67MPa、pH7.81、溫度45.0℃，脫苦后濾液中氨基態(tài)氮透過率為82.6%，濾液苦味評分為1.8分；對膜分離脫苦前后酶解液中基本營養(yǎng)組成含量進行對比分析，經膜分離脫苦處理后的杏鮑菇酶解液中氨基酸總量、鳥苷酸和肌苷酸的保留率分別為82.6%、79.9%和75.2%。結果表明，酶解液經膜分離脫苦后，氨基酸和核苷酸的保留率均較高，脫苦效果良好，說明膜分離技術可應用于蛋白質酶解液的脫苦。

杏鮑菇，酶解液，膜分離，脫苦工藝

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側耳，富含蛋白質、糖類物質和氨基酸，其中必需氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸分別占氨基酸總量的40.06%、19.39%和24.64%[1-2]。鑒于杏鮑菇所含成分具有的藥食兼用價值，近年來以杏鮑菇為原料提取其有效成分的研究逐漸成為熱點。由于酶法提取具有條件溫和，對有效成分營養(yǎng)功能特性損害小等優(yōu)點，因此為研究的重點，但酶法提取液具有較為明顯的苦味，從而影響了酶解產物被進一步深加工和利用。據文獻報道[3-8]，蛋白質酶解液之所以產生苦味，其原因是由于蛋白質經水解成多肽和氨基酸后，埋藏在其內部的疏水性氨基酸殘基會暴露出來與味蕾接觸，從而產生苦味。多肽的苦味程度不僅與其氨基酸的組成、序列和立體結構均有著密切的聯(lián)系，而且還取決于多肽相對分子量的大小和疏水性的強弱，分子量大于6000u的多肽無苦味，而介于500～1000u的短肽苦味最強。目前蛋白質酶解產物中苦味肽的脫除方法[3-4]主要有選擇性分離法、掩埋法和生物酶解法，其中選擇性分離法又包括吸附分離、沉淀分離、萃取分離和膜分離。與其他分離方法相比，膜分離具有操作簡單、針對性強、分離效率高以及對酶解液中其他無苦味的營養(yǎng)物質影響小等優(yōu)點，因此本文采用截留分子量為500u納濾膜將杏鮑菇酶解液中氨基酸、核苷酸等呈味物質與苦味肽分離，為杏鮑菇酶解液的加工和利用掃清障礙以及膜分離技術廣泛應用于脫除蛋白質水解產物中的苦味肽提供應用范例和理論基礎。

表1 苦味感官評分表Table 1 The table of bitter taste sensory score

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 福建農林大學菌菇研究中心提供；纖維素酶（1.5×103U·g-1）、中性蛋白酶（2.0×104U·g-1）和木瓜蛋白酶（6.5×104U·g-1） 南寧龐博生物工程有限公司提供；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛 均為分析純；甲醇為色譜純 國藥集團化學試劑有限公司提供；鳥苷酸和肌苷酸標準品 中國進出口商品檢驗檢疫技術研究所提供；氨基酸混合標準樣 深圳虹彩祥根生物科技有限公司提供。

AR1140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZD-2自動電位滴定儀、自動攪拌器 上海精密科學儀器廠；XMTD-8222自動恒溫振蕩器 上海精宏實驗室設備有限公司；TDL-40B電動離心機上海安亭科學儀器廠；L-8800氨基酸自動分析儀 日立公司；SPD-20A高效液相色譜 日本島津；YWMIC-03實驗室微型多功能膜分離設備 合肥禹王膜工程技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇酶解液的制備 杏鮑菇干粉→加水勻漿（料液質量比為1∶20）→第一步纖維素酶酶解（溫度48.5℃、pH5.50、酶的添加量0.102×103U·g-1、酶解時間210min）→第二步復合酶（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=3∶2）酶解（溫度57.5℃、pH6.75、酶的添加量4.08×103U·g-1、酶解時間210min）→沸水浴10min滅酶→離心（4000r/min、10min）→酶解液

1.2.2 苦味的評定 采用感官評定的方法[7]，將蛋白酶水解液調至pH為6.50（用濃度為1.00mol/L鹽酸或氫氧化鈉），并加熱至60℃。挑選20名品嘗者（男女各l0人，均為不吸煙者），并將咖啡因配成濃度分別為：0%、0.025%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%，其對應的評分值和苦味程度如表1所示。按此評分標準，20名品嘗者品嘗酶解液的苦味，并與標準液比較進行評分，取平均值表示苦味程度。

1.2.3 氨基態(tài)氮透過率的測定 先用蒸餾水將濾液體積稀釋到與膜分離前溶液相同體積，再測定濾液中氨基態(tài)氮含量，其測定方法參照GB/T 5009.39-2003中甲醛滴定法。氨基態(tài)氮透過率按式（1）計算：

1.2.4 氨基酸組成、肌苷酸和鳥苷酸的測定 氨基酸組成的測定參照潘欣等[9]的測定方法，肌苷酸和鳥苷酸的測定參照王勇等[10]的測定方法。

1.2.5 500u納濾膜分離脫苦實驗設計

1.2.5.1 膜分離脫苦工藝流程

1.2.5.2 膜分離脫苦實驗設計 根據膜分離技術的特點以及膜分離設備的性能，以濾液中氨基態(tài)氮透過率和苦味評分為主要評價指標，首先通過單因素實驗分別考察不同操作壓力（0.40、0.50、0.60、0.70、0.80MPa）、酶解液pH（6.00、7.00、8.00、9.00、10.00）和酶解液溫度（25.0、30.0、35.0、40.0、45.0℃）對實驗指標的影響，繼而采用響應面實驗設計對壓力、pH和溫度作進一步的優(yōu)化，從而獲得最佳的500u納濾膜分離脫苦條件[11]。優(yōu)化實驗因素水平如表2所示。

表2 優(yōu)化實驗因素水平表Table 2 The factors and levels table of optimize experiment

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 壓力對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響 固定酶解液pH 7.00、溫度30.0℃，不同壓力對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響如圖1所示。

圖1 壓力對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響Fig.1 Effectof pressure on the transmittance of amino nitrogen and debittering

圖1表明，壓力的增加對氨基態(tài)氮透過率和苦味評分的影響趨勢均呈先升后降趨勢，其原因為壓力的上升加劇了膜兩側濃度差極化的形成，從而使得膜的通過性降低所致；由圖中可以看出，當壓力位0.70MPa時，氨基態(tài)氮透過率75.1%，苦味評分2.8分，考慮到充分分離出游離氨基酸用于加工杏鮑菇風味調味品，因此初步確定較佳的分離壓力范圍為0.70MPa左右。

2.1.2 pH對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響 固定操作壓力0.70MPa、溫度30.0℃，不同酶解液pH對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響如圖2所示。

圖2 pH對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響Fig.2 Effectof pH on the transmittance ratio of amino nitrogen and debittering

圖2表明，隨著pH的上升，氨基態(tài)氮透過率和苦味評分均呈先上升后下降趨勢，其原因是苦味肽為兩性物質，當pH在其等電點附近時，苦味肽的溶解度最低而不易脫除，而當pH遠離其等電點時，苦味肽的溶解度又上升而易于脫除。由圖中可以看出，當pH為8.00時，氨基態(tài)氮透過率最高，而苦味評分2.7分，因此初步確定較佳的脫苦pH范圍為8.00左右。

2.1.3 溫度對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響 固定操作壓力0.70MPa、酶解液pH8.00，不同酶解液溫度對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響如圖3所示。

圖3 溫度對氨基態(tài)氮透過率和脫苦效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen and debittering

圖3表明，溫度的上升均能明顯提高氨基態(tài)氮透過率和苦味評分，其原因為溫度的上升降低了酶解液的粘度，提高了其分散性所致；由圖中可以看出，當溫度上升到40.0℃之后，氨基態(tài)氮透過率的增加趨勢趨于平緩，且苦味評分還弱有上升趨勢，結合納濾膜對溫度的承受能力，因此初步確定較佳的脫苦溫度范圍為40.0℃左右。

2.2 響應面優(yōu)化實驗結果與分析

2.2.1 實驗結果的回歸與方差分析 響應面優(yōu)化實驗設計方案與結果如表3所示。

表3 實驗設計與結果Table 3 Experimental designs and results

采用Design Expert 8.05數據分析軟件對表3中的實驗結果進行方差分析，結果見表4。

根據表4方差分析結果，剔除p＞0.05的不顯著項，得到簡化后的回歸方程式（2）、式（3）。

比較回歸方程式（2）一次項回歸系數絕對值的大小可知各因素對氨基態(tài)氮透過率影響的主次順序為：溫度＞pH＞壓力，一次項、二次項和因素間的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響均顯著。比較回歸方程式（3）一次項回歸系數絕對值的大小可知各因素對苦味評分影響的主次順序為：壓力＞pH＞溫度，一次項、壓力和溫度二次項對苦味評分的影響顯著。回歸方程式（2）和式（3）的失擬項均不顯著，可用來預測膜分離條件的變化對氨基態(tài)氮透過率和濾液苦味評分的影響。

表4 方差分析結果Table 4 The results of variance analysis

2.2.2 因素的效應分析 采用Design Expert 8.05數據分析軟件對表3中實驗結果進行響應面分析，分析各因素及相互間的交互作用對氨基態(tài)氮透過率和苦味評分的影響。

2.2.2.1 各因素對氨基態(tài)氮透過率的影響 各因素間的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響如圖4～圖6所示。

圖4 壓力和pH對氨基態(tài)氮透過率的影響Fig.4 Effect of pressure and pH on the transmittance ratio of amino nitrogen

圖4表明，在實驗因素水平范圍內，壓力和pH對氨基態(tài)氮透過率的影響相同，均呈先升后降趨勢；由圖中等高線的疏密度和形狀可以看出，壓力和pH的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響顯著，其中氨基態(tài)氮透過率對壓力的變化較pH更為敏感。

圖5 壓力和溫度對氨基態(tài)氮透過率的影響Fig.5 Effectof pressure and temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen

圖5表明，當溫度一定時，隨著壓力的增加，氨基態(tài)氮透過率先增加到最大值后開始下降；在實驗因素水平范圍內，當壓力一定時，氨基態(tài)氮透過率隨著溫度的上升而增加。由圖中等高線的疏密度和形狀可以看出，壓力和溫度的交互影響對氨基態(tài)氮透過率的影響顯著，其中氨基態(tài)氮透過率對壓力的變化較溫度更為敏感。

圖6 pH和溫度對氨基態(tài)氮透過率的影響Fig.6 Effectof pH and temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen

圖6表明，當溫度一定時，氨基態(tài)氮透過率隨著pH的上升而呈現(xiàn)先增后降趨勢；當pH一定時，在實驗因素水平范圍內，隨著溫度的上升，氨基態(tài)氮透過率持續(xù)增加。由圖中等高線的疏密度可以看出，pH和溫度的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響很顯著。

綜合分析，各因素間的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響均很明顯；在實驗因素水平范圍內，溫度的上升有利于提高氨基態(tài)氮透過率；只有壓力和pH處于適當的水平時，才能獲得較高的氨基態(tài)氮透過率。2.2.2.2 各因素對苦味評分的影響 各因素間的交互作用對氨基態(tài)氮透過率的影響如圖7～圖9所示。

圖7 壓力和pH對苦味評分的影響Fig.7 Effect of pressure and pH on the bitterness score

圖7表明，當pH一定時，隨著壓力的增加，苦味評分呈現(xiàn)先增后降趨勢；當壓力一定時，在實驗因素水平范圍內，苦味評分隨著pH的增加而上升。由圖中等高線的疏密度可以看出，壓力和pH的交互作用對苦味評分的影響不顯著。

圖8 壓力和溫度對苦味評分的影響Fig.8 Effectof pressure and temperature on the bitternessscore

圖8表明，在實驗因素水平范圍內，壓力和溫度對苦味評分的影響相同，均呈先升后降的趨勢；由圖中等高線的疏密度可以看出，苦味評分對壓力和溫度的交互作用不敏感。

表5 酶解液中氨基酸與核苷酸含量（g/100mL）Table 5 The contentof amino acids and nucleeotide in the enzymatic hydrolyzate（g/100mL）

圖9 pH和溫度對苦味評分的影響Fig.9 Effectof pH and temperature on the bitterness score

圖9表明，當溫度一定時，在實驗因素水平范圍內，苦味評分隨著pH的增加而上升；當pH一定時，在實驗因素水平范圍內，苦味評分隨著溫度的增加而上升。由圖中等高線的疏密度可以看出，苦味評分對pH和溫度的交互作用不敏感。

綜合分析，各因素間的交互作用對苦味評分的影響不明顯；在實驗因素水平范圍內，各因素水平值的增加均會提高苦味評分值。

2.2.3 最優(yōu)脫苦條件的確定和驗證 通過Design Expert 8.05數據分析軟件對表3實驗結果進行綜合優(yōu)化分析，得出最優(yōu)的500u納濾膜分離脫苦條件為：壓力0.67MPa、pH7.81、溫度45.0℃。軟件預測的氨基態(tài)氮透過率為81.3%、苦味評分2.0分；在該工藝條件下對軟件優(yōu)化結果進行實驗驗證，測得脫苦后的濾液中氨基態(tài)氮透過率為82.6%，對濾液的苦味評分為1.8分，表明酶解液在該最優(yōu)工藝條件下經納濾膜處理后，苦味肽基本被脫除。

2.3 脫苦后酶解液中的氨基酸與核苷酸含量

在上述最優(yōu)脫苦條件下所得酶解液中氨基酸和核苷酸的含量如表5所示。

由表5可知，與膜分離前相比，經膜分離脫苦處理后的杏鮑菇酶解液中游離氨基酸總量、鳥苷酸和肌苷酸的保留率分別為82.6%、79.9%和75.2%；按照寧正祥[12]對氨基酸呈味特性的分類，在脫苦后的酶解液中，帶有鮮味和甜味的氨基酸分別占氨基酸總量的56.4%和50.9%，這表明杏鮑菇酶解液中呈鮮味物質含量非常豐富，是一款功能突出、營養(yǎng)豐富的調味基料。然而脫苦后的酶解液中還含有42.4%帶有苦味的氨基酸，這也從一定程度上解釋了脫苦后的酶解液苦味評分為1.8分的原因，雖然含有部分苦味氨基酸，但苦味評分的結果表明苦味對口感的影響并不明顯。

3 結論

通過單因素實驗和響應面實驗設計優(yōu)化，得到500u納濾膜脫苦的最優(yōu)條件為壓力0.67MPa、pH7.81、溫度45.0℃，經脫苦后濾液中氨基態(tài)氮透過率為82.6%，濾液苦味評分為1.8分。對膜分離脫苦前后酶解液中基本營養(yǎng)組成含量進行對比分析，經膜分離脫苦處理后的杏鮑菇酶解液中游離氨基酸總量、鳥苷酸和肌苷酸的保留率分別為82.6%、79.9%和75.2%。

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Study on membrane separation debittering process of the Pleurotus eryngii enzymolysis liquid

XIONGW en-fei1，2，CHEN Ri-chun1，TANG Sheng-chun1，SONG Hong-bo2
（1.Fuzhou Institute of Food Industry，F(xiàn)uzhou 350013，China；
2.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Study on debittering p rocess of memb rane separation technology on Pleurotus eryngii hyd rolysates. On the basis of the sing le-fac tor test，using response surface op tim ization，get the op timal cond itions of the 500u nanofiltration memb rane separation debittering:p ressure 0.67MPa，pH7.81，temperature 45.0℃.In the debittering filtrate，transm ittance of the am ino nitrogen was 82.6%and the bitter score was 1.8.Analysis of the basic nutrition content in the enzymatic solution and debittering filtrate were investigated，in the latter the am ino acids，guanosine monophosphate and inosine monophosphate retention rates were 82.6%，79.9%and 75.2%，respectively.The results showed that in the enzymatic solution，am ino acids and nuc leotide retention were higher，the effect of was debittering was good and the membrane separation technology could be app lied to the p rotein enzyme solution to take off the bitter.

Pleurotus eryngii，enzymolysis liquid，memb rane separation，debittering p rocess

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0287-05

2012－03－30

熊文飛（1985-），男，碩士研究生，研究方向：食品加工理論與應用。