重組人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）血紅素樣蛋白表達優(yōu)化

李彥杰，肖國生，劉仁華，楊俊年

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 404000；

2.三峽庫區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心，重慶 404000）

重組人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）血紅素樣蛋白表達優(yōu)化

李彥杰1，2，肖國生1，劉仁華1，楊俊年1

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 404000；

2.三峽庫區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心，重慶 404000）

為確定重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）最佳表達條件。在單因素實驗的基礎之上，以目的蛋白PEX表達量為響應值，應用Box-Behnken中心組合設計建立數(shù)學模型，進行響應面分析。響應面分析確定的最優(yōu)因素水平組合為：LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導時菌液OD600為0.60，IPTG誘導濃度為0.60mmol/L，誘導培養(yǎng)時間為5.0h。對此工藝條件進行驗證得到目的蛋白PEX表達量為20.98mg/L。結(jié)果顯示，優(yōu)化了基因重組大腸桿菌表達人PEX的條件，為實現(xiàn)基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX奠定了基礎。

大腸桿菌，基質(zhì)金屬蛋白酶2，血紅素樣蛋白，Box-Behnken設計

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是一組Zn2+依賴性內(nèi)源性蛋白水解酶超家族，在降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過程中扮演著重要角色[1-3]。MMP-2是該家族的重要一員，主要由成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、成骨細胞和單核細胞等多種細胞分泌合成[3-5]。MMP-2參與降解IV型膠原蛋白，I型膠原蛋白和細胞外糖蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[3，6]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）血紅素樣蛋白（matrixmetalloproteinase 2 hemopexin-like C-terminal domain，PEX）是除MMP-7、MMP-23和MMP-26外所有MMPs在羧基端共有的結(jié)構(gòu)域，體內(nèi)提取的PEX是MMPs的內(nèi)源性抑制劑[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2-PEX能抑制MMP-2對ECM的降解、血管的形成、細胞的遷移和增殖[11-15]。提取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞總RNA，RTPCR克隆人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）血紅素樣蛋白的cDNA序列PEX，構(gòu)建原核表達載體PET42a-PEX，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導后顯示目的蛋白為可溶性表達[16]。本文采用Box-Behnken設計（Box-Behnken design，BBD）的響應面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化重組人PEX的可溶性表達條件，為實現(xiàn)基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX） 本實驗室保存。

M ini-proteantetra小型垂直電泳槽 美國Bio-rad公司；GelDoc XR凝膠成像儀 配有Quantity One分析軟件，美國Bio-rad公司；5418型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；S20K型pH計 瑞士Mettler-Toledo公司；Biophotometer Plus生物分光光度計 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 重組大腸桿菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）涂布到含有100mg/L AMP的LB平板上倒置過夜，挑取鑒定正確的單克隆接種到100m L含100mg/L AMP的LB液體培養(yǎng)基中，37℃和220r/m in振蕩培養(yǎng)過夜，然后按5‰接入500m L含100mg/L AMP的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集OD600值為0.20、0.40、0.60、0.80和1.00的菌液10m L備用。

1.2.2 單因素實驗設計 以目的蛋白PEX表達量為評價指標，研究不同LB培養(yǎng)基pH、誘導時菌液OD600值、IPTG誘導濃度和誘導培養(yǎng)時間對目的蛋白表達量的影響。

1.2.3 目的蛋白表達量分析 裂解單因素誘導表達后細菌培養(yǎng)物，10000r/m in離心10m in，取上清液進行SDS-PAGE，Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像儀掃描電泳膠，用Quantity One 4.4.0軟件分析計算目的蛋白表達量。

1.2.4 響應面的組合實驗 根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件進行BBD實驗設計，優(yōu)化PEX可溶性表達工藝。根據(jù)單因素分析結(jié)果，以LB培養(yǎng)基pH（X1），誘導時菌液OD600（X2），IPTG誘導濃度（X3）和誘導培養(yǎng)時間（X4）進行4因素3水平Box-Behnken實驗設計。以-1、0、1代表自變量水平，實驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 實驗因素和水平編碼表Table 1 Coding of levels and factors chosen for the trials

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白表達的單因素分析

圖1 LB培養(yǎng)基pH對PEX表達的影響Fig.1 Effectof pH in LB on expression of PEX

2.1.1 LB培養(yǎng)基pH對目的蛋白表達的影響 固定誘導時菌液OD600為0.40，IPTG濃度為0.40mmol/L，誘導時間3.0h，LB培養(yǎng)基pH分別設定為6.00、6.50、 7.00、7.50、8.00，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著pH由6.00增高至7.00，目的蛋白表達量逐步上升，并在pH在7.00達到最大值，這是因為大腸桿菌在發(fā)酵中產(chǎn)酸會使培養(yǎng)基pH下降，而培養(yǎng)基pH下降后會抑制大腸桿菌的生長繁殖。當pH大于7.50，目的蛋白表達量開始下降。故選擇LB培養(yǎng)基pH為7.0。

2.1.2 誘導時菌液OD600對目的蛋白表達的影響 固定誘導時LB培養(yǎng)基pH為7.00，IPTG濃度為0.40mmol/L，誘導時間3.0h，誘導時菌液OD600值分別設定為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00，結(jié)果見圖2。由圖2可知，OD600為0.20時，目的蛋白表達量很低，這是因為此時培養(yǎng)液中重組工程菌絕對數(shù)量較小所致。隨著OD600上升，目的蛋白表達量逐步上升，并在OD600為0.60時表達量最高。OD600大于0.60，目的蛋白表達量下降，這可能與因為菌液OD600過大時，菌液中活菌數(shù)絕對數(shù)量下降有關(guān)。故選擇誘導時菌液OD600為0.60。

圖2 菌液OD600對PEX表達的影響Fig.2 Effectof bacterial liquid OD600 on expression of PEX

2.1.3 IPTG誘導濃度對目的蛋白表達的影響 固定誘導時LB培養(yǎng)基pH為7.00，OD600為0.60，誘導時間3.0h，IPTG誘導濃度分別設定為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmol/L，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著IPTG誘導濃度由0.20mmol/L增高至0.60mmol/L，目的蛋白表達量逐步增加至最高。IPTG誘導濃度由0.60mmol/L增高至0.80mmol/L，目的蛋白表達量緩慢降低。這可能是因為高濃度IPTG的細胞毒性作用抑制了宿主菌的生長繁殖。故IPTG誘導濃度選擇0.60mmol/L。

圖3 IPTG誘導濃度對PEX表達的影響Fig.3 Effect of induce concentration of IPTG on expression of PEX

2.1.4 誘導培養(yǎng)時間對目的蛋白表達的影響 固定固定誘導時LB培養(yǎng)基pH為7.00，OD600為0.60，IPTG誘導濃度為0.60，誘導培養(yǎng)時間分別設定為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h，結(jié)果見圖4。由圖4可知，誘導培養(yǎng)2.0、3.0h時，目的蛋白表達量較低。誘導培養(yǎng)4.0h時，目的蛋白表達量最高，隨著誘導培養(yǎng)時間增加，目的蛋白表達量緩慢降低。故選擇誘導培養(yǎng)時間為4.0h。

圖4 誘導培養(yǎng)時間對PEX表達的影響Fig.4 Effectof induce time on expression of PEX

2.2 響應面的實驗設計與結(jié)果分析

2.2.1 實驗設計方案與結(jié)果分析 實驗設計方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計方案及結(jié)果Table 2 Design of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.0軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合回歸模型為二次方程：Y=18.81+ 4.86X1+0.14X2+0.34X3+3.20X4+0.17X1X2+0.34X1X3+ 2.13X1X4-0.91X2X3+0.087X2X4-0.27X3X4-6.82X12-0.77X22-0.94X32-2.77X42?；貧w模型顯著性檢驗結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型極顯著（p＜0.01）。模型及一次項X1、X4，二次項X12、X42和交互項X1X4極顯著（p＜ 0.01），模型中其余項均不顯著（p＞0.05），表明各因素對目的蛋白的表達量不是簡單的線性關(guān)系。計算擬合模型的判定系數(shù)R2=0.9763，校正判定系數(shù)RAdj2= 0.9527，預測判定系數(shù)RPred2=0.8720，且失擬項不顯著（p＞0.05），表明模型擬合程度比較好，可以用此模型對目的蛋白PEX表達量進行分析、預測和確定最佳表達工藝條件。

表3 回歸模型顯著性檢驗Table 3 Test for significance of regressionmodel

2.2.2 回歸模型的驗證實驗 利用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件，由模型的二次方程計算得4個因素最優(yōu)值為：LB培養(yǎng)基pH為7.48，誘導時菌液OD600為0.63，IPTG誘導濃度為0.62mmol/L，誘導培養(yǎng)時間為4.8h。在此組合下響應值Y在實驗區(qū)域內(nèi)可達最優(yōu)點，即重組人PEX表達量最大，理論值為21.21mg/L。為驗證上述優(yōu)化結(jié)果，按照確定的最優(yōu)條件，實際取LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導時菌液OD600為0.60，IPTG誘導濃度為0.60mmol/L，誘導培養(yǎng)時間為5.0h進行發(fā)酵表達，重復實驗3次，重組人PEX的實測平均值為20.98mg/L，與模型的預測值較為接近，進一步說明此回歸模型的擬合程度較好。

3 結(jié)論

外源基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的高效表達，除受表達系統(tǒng)的啟動子、終止子、核糖體結(jié)合位點和密碼子偏愛性等影響之外，還受如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、IPTG誘導濃度、誘導表達時間、誘導時菌液OD600值和培養(yǎng)基營養(yǎng)成分等外界環(huán)境因素的影響。因此選擇合適的誘導培養(yǎng)條件，可有效提高目的基因的表達量，從而降低實驗成本，提高表達效率。

響應面分析通過研究實驗指標與多個實驗因素間的回歸關(guān)系建立回歸方程，然后求解最優(yōu)值。響應面實驗設計分析要求實驗因素已在最優(yōu)值范圍附近，因此本研究首先通過單因素實驗選定了參與響應面實驗的LB培養(yǎng)基pH、誘導時菌液OD600、IPTG誘導濃度和誘導培養(yǎng)時間4個因素，并設立不同水平，然后應用響應面分析法建立了目的蛋白表達量的二次多項數(shù)學模型，并通過手動優(yōu)化模型。通過對優(yōu)化后模型方程求解，得到最佳的工藝條件是：LB培養(yǎng)基pH為7.50，誘導時菌液OD600為0.60，IPTG誘導濃度為0.60mmol/L，誘導培養(yǎng)時間為5.0h。此條件下目的蛋白表達量為20.98mg/L。驗證實驗PEX表達量接近最大預測值，顯示擬合模型對于基因重組原核工程菌發(fā)酵法制備重組PEX具有實踐意義。

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Optim ization of expression conditions of recombinant human-source matrix metalloproteinase 2 hemopexin-like C-term inal domain

LIYan-Jie1，2，XIAO Guo-sheng1，LIU Ren-hua1，YANG Jun-nian1
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；
2.Research Centre for Sustainable Development，Three Gorges Reservoir Region，Chongqing 404000，China）

To op tim ize fermentation cond itions of Genetically Engineered Escherichia coli（BL21（DE3）/PET42a-PEX），Box-Behnken design was used to estab lish mathematical model based on sing le-factor tests.The response surface methodology（RSM）analysis result showed that the op timal scale of fac tors was：Luria-Bertani liquid culture medium pH7.50，bac terial liquid op tical density（OD600）0.60，induce concentration of IPTG 0.60mmol/L，induce time 5.0h.Under these op tim ized cond itions，the yield of PEX was 20.98mg/L.Op tim ization of exp ression cond itions of genetically engineered Escherichia coli exp ressing recombinant human-source matrixmetallop roteinase 2 hemopexin-like C-term inaldomain was studied，and laid the foundation of generation of human recombinant PEX by fermentation.

Escherichia coli；matrixmetallop roteinase 2；hemopexin-like C-term inaldomain；Box-Behnken design

Q815

A

1002-0306（2012）20-0248-04

2012－04－28

李彥杰（1979-），男，碩士，講師，研究方向：生物技術(shù)。

教育部科學技術(shù)研究重點項目（211150）；重慶三峽學院項目（2008-sxxyqn-31）。