膽堿酯酶保藏方法的篩選及固定化研究

樊秀花，何慶峰，張愛琳

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384；

2.天津市農(nóng)產(chǎn)品加工科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化基地，天津 300384）

膽堿酯酶保藏方法的篩選及固定化研究

樊秀花1，2，何慶峰1，2，張愛琳1，2

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384；

2.天津市農(nóng)產(chǎn)品加工科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化基地，天津 300384）

目的：對膽堿酯酶進(jìn)行保藏研究，以期得到最佳的酶活力。方法：以小麥酯酶為實(shí)驗(yàn)材料，采取冷藏、冷凍和酶的固定化的措施，添加不同種類和不同比例的防腐劑，采用不同的包裝材料進(jìn)行比較研究。結(jié)果：能夠保持膽堿酯酶的酶活力方法是：設(shè)定保藏溫度為-20℃，添加0.1%硫柳汞采用塑料瓶包裝儲藏，這樣可以很好地保持酶液的酶活力。結(jié)論：采用低溫冷凍保藏膽堿酯酶并且添加一定劑量的防腐劑可以很好的保持膽堿酯酶酶活力。

小麥，膽堿酯酶，保藏，固定化

進(jìn)入21世紀(jì)，全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢是更加注意農(nóng)產(chǎn)品及食品的質(zhì)量安全性，倡導(dǎo)安全優(yōu)質(zhì)的綠色食品[1]。近年來，由于農(nóng)藥的大量使用和不合理的使用，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品尤其是果蔬產(chǎn)品農(nóng)藥殘留過量，嚴(yán)重地危害著人類的健康，而且出口農(nóng)產(chǎn)品因農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重影響了中國的外貿(mào)聲譽(yù)，尤其是在果蔬的農(nóng)藥殘留中，又以有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留較為常見[2]。為了確保人類的健康和安全，加強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)督和檢測顯得尤為重要。因此，建立快速高效的農(nóng)藥殘留檢測機(jī)制是一個(gè)十分重要的問題[3]。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法主要是氣相色譜法和高效液相色譜法等，但儀器昂貴，操作過程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)及檢測成本高，也不適用于現(xiàn)場監(jiān)測[4]。酶抑制法測定有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，具有快速、簡便、靈敏及成本低等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大基層監(jiān)督部門、生產(chǎn)基地及市場的歡迎[5]，便其得到快速的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)著重研究酶抑制法的關(guān)鍵用酶——膽堿酯酶的保藏方法，從春麥和冬麥中提取膽堿酯酶，采取冷藏和冷凍的措施，添加不同種類和不同比例的防腐劑，采用不同的包裝材料進(jìn)行比較研究，適時(shí)檢測各自方法的酶活力，并進(jìn)行比較，尋找一種適合膽堿酯酶保藏的最有效的途徑和方法，膽堿酯酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的膽堿酯酶可用作于檢測蔬菜水果中的農(nóng)藥殘留的快速檢測用酶[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

春麥、冬麥 均由天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供，小麥浸泡一定時(shí)間后，用多功能組織搗碎機(jī)破碎，離心分離，置于離心管中進(jìn)行離心，以4000r/m in離心10m in，取上清液（記錄體積）即為膽堿酯酶粗酶液，冷藏備用，小麥酯酶前期研究的最優(yōu)提取方法為：按1∶4的比例加入蒸餾水，4℃浸泡18h，用多功能組織搗碎機(jī)破碎5m in，5000r/m in常溫離心15m in，酶液活力較高。

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；7200可見光分光光度計(jì) 尤尼科（上海）儀器有限公司；離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；加樣器（100～1000μL） 大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 防腐劑實(shí)驗(yàn)

添加硫柳汞、硫酸銨、苯甲酸、甘油不同種類的防腐劑并設(shè)0.1%、1%兩個(gè)濃度進(jìn)行保藏。

1.3 膽堿酯酶的固定化

分別用蒸餾水和pH 6.4磷酸鹽緩沖液浸泡提取膽堿酯酶，然后用相同的提取液進(jìn)行固定化處理，方法為：

a.固定化載體的預(yù)處理 樹脂在室溫下加去離子水浸泡，使其充分溶脹。對充分溶脹的濕樹脂進(jìn)行離心脫水。按1.5m L/g的比例在濕樹脂中加入0.5mol/L的NaOH溶液，在室溫條件下攪拌數(shù)小時(shí)，然后用去離子水洗滌到中性為止。如此制備得Cl-鹽型陰離子交換樹脂。加適量去離子水于4℃條件下貯存?zhèn)溆?。以上離心脫水的Cl-型濕樹脂中加入0.5mol/L的NaOH溶液，在室溫條件下攪拌數(shù)小時(shí)，然后用去離子水洗滌到中性為止，如此制備得OH-型陰離子交換樹脂。加適量去離子水于4℃條件下貯存?zhèn)溆肹7]。

b.酶的固定化 按4∶1（m L∶g）的比例，將粗酶液與制備好的樹脂混合，在搖床上進(jìn)行搖晃。經(jīng)一定時(shí)間后，將固定化酶樹脂與溶液分開。用與提取酶用的相同液體，按樹脂∶液體=1∶10（m L∶g）的比例，對以上的固定化酶洗滌8次。最后將固定化酶浸在同樣的液體中，于4℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

c.固定化酶的活性測定 用適當(dāng)容器取適量離心脫水的固定化酶，按1∶10比例加入緩沖液，使緩沖液充分浸潤固定。以上體系中加入80mol/L的α-乙酸萘酯丙酮溶液使其在體系中的濃度達(dá)到4× 10-4mol/L，立即在搖床上搖晃5m in，之后測定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保藏溫度對膽堿酯酶活力的影響

圖1 保藏溫度和保藏時(shí)間對膽堿酯酶活力的影響Fig.1 Influence of CHE activity on the storage temperature and storage time

由圖1可知，粗酶液在4和-20℃兩個(gè)保藏溫度下隨著保藏天數(shù)的延長，酶活力均呈下降趨勢，4℃保藏條件下的酶活力下降速度快于-20℃保藏條件，至保藏36d時(shí)酶活力幾乎完全喪失，而-20℃下的酶活力在保藏36d后仍能保持原來的1/3左右，由此可見，溫度對膽堿酯酶的保藏是一個(gè)關(guān)鍵的影響因素，冷凍低溫保藏能較好地保持酶活力，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，每次使用前必須提前將酶液融化并使其達(dá)到室溫，否則對檢測結(jié)果有影響。

2.2 不同種類、不同濃度的防腐劑對酶液的保藏效果

2.2.1 在4℃保藏中添加不同種類不同濃度防腐劑的春麥粗酶液酶活力變化 由圖2可知，在4℃下保藏過程中，添加不同種類防腐劑對保藏前期對膽堿酯酶活力都有一定作用，以添加0.1%甘油為防腐劑的酶液儲藏效果最佳，儲藏3d后酶活力為38.2U，未加防腐劑處理的原酶液同期測定酶活力為23.8U，但是在保藏27d后，酶活力下降迅速，添加防腐劑的酶液與原酶液酶活力差別不大，可見加防腐劑保藏對保藏后期的酶活力幾乎無作用。

圖2 不同種類不同濃度的防腐劑對膽堿酯酶活力的影響Fig.2 Influence of CHE activity on the kinds and concentrations of preservative

2.2.2 在-20℃保藏中添加不同種類不同濃度防腐劑的春麥粗酶液酶活力變化 由圖3可見，在-20℃保藏過程中，在保藏前期添加不同種類不同濃度的防腐劑對保持膽堿酯酶活力作用效果明顯，儲藏36d時(shí)酶活力還在10U左右，其中，加防腐劑為0.1%硫柳汞、0.1%甘油的保藏效果要比1.0%甘油和0.1%硫酸銨保藏效果好，苯甲酸的效果最差。但是隨著保藏時(shí)間的延長，效果逐漸漸弱，到了后期各處理的酶活力的差別很小。綜合圖2、圖3，添加0.1%甘油保藏的酶活力效果好。

圖3 不同種類不同濃度防腐劑對膽堿酯酶活力的影響Fig.3 Influence of CHE activity on the kinds and concentrations of preservative

2.3 固定化處理對酶的耐藏性影響

分別稱取適當(dāng)離心脫水的固定化酶，按1∶10比例加入固定提酶處理用的磷酸鹽緩沖液和蒸餾水，使它們充分浸潤20m in后，分別測定緩沖液固定化酶和純水固定化酶的酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4 不同固定化處理的膽堿酯酶活力比較Fig.4 Influence of CHE activity on the immobilized processing

從圖4可知，以大孔徑陰離子（OH—）交換樹脂為載體，用離子結(jié)合法制備得到的兩種固定化酶活力比較高，在保藏4d時(shí)它們的酶活力都能達(dá)到27U以上，隨著保藏期的延長酶活力都呈降低趨勢，而且用緩沖液磷酸鹽固定化和用純水固定化后的酶活力差別很小，這說明提酶液種類對固定化酶保藏效果影響不大。這可能由于酶液中OH-與樹脂的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于緩沖液離子及其他離子與樹脂的結(jié)合力，從而使得固定化酶呈現(xiàn)穩(wěn)定性。

2.4 原酶液與透析純化酶、固定化酶的耐藏性比較

圖5 不同純化處理膽堿酯酶活力比較Fig.5 Influence of CHE activity on the purification treatment

從圖5可知，原酶液、透析純化酶和固定化酶的酶活力存在著明顯的差異，透析純化的酶液在儲藏前期酶活力可以達(dá)到45U，在儲藏40d時(shí)酶活力還可以達(dá)到25U。各酶在保藏過程中酶活力均呈下降趨勢，透析處理的酶液下降趨勢稍微緩慢，緩沖液固定化酶和純水固定化酶它們的酶活力及耐藏性均無明顯差別，所以，從耐藏性比較，各酶液無明顯差異。以后的酶液可以采用透析純化處理后的酶作為工作酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。

3 結(jié)論

3.1 通過研究小麥酯酶的保藏溫度設(shè)定保藏溫度為-20℃，添加0.1%甘油瓶包裝儲藏可以很好地保持酶液的酶活力。

3.2 以大孔徑陰離子（OH-）交換樹脂為載體，用離子結(jié)合法制備得到的兩種固定化酶活力比較高，在保藏4d時(shí)它們的酶活力都能達(dá)到27U以上。

[1]侯迪名.植物酯酶法快速測定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的研究[J].食品科學(xué)，2002，23（7）：111-115.

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Study on cholinesterase preservation method of screening and immobilized

FAN Xiu-hua1，2，HE Qing-feng1，2，ZHANG Ai-lin1，2
（1.Departmentof Food Science，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；
2.Tianjin Agricultural Products Processing Scientific Innovation&Achievement Transform Base，Tianjin 300384，China）

Ob jective：Study the p reservation methods about the CHE，in order to get the best enzyme activity. Methods：Based wheat on the testing material，took cold storage，frozen and enzyme immobilization measures，add ing d ifferent types and different p roportions of p reservatives，using the different packing material were investigated.Results：The result showed that the better effect of remain well enzyme solution of the enzyme activity was set for-20℃ tem perature p reservation，add ing 0.1%thimerosal used p lastic bottles packaging storage.Conc lusion：The cold p reservation CHE and add ing regular doses of p reservative could make cholinesterase enzyme very good maintenance.

wheat；cholinesterase；p reservation；immobilized

TS201.6

A

1002-0306（2012）22-0246-03

2011－10－21

樊秀花（1980-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品安全快速檢測與研究。

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20100612）。