Aspergillus niger C15產(chǎn)柚苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

李志堅(jiān)，譚興和，李高陽

（1.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125；

2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128）

Aspergillus niger C15產(chǎn)柚苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

李志堅(jiān)1，譚興和2，李高陽1

（1.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125；

2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128）

通過正交實(shí)驗(yàn)對黑曲霉菌株C15產(chǎn)柚苷酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aspergillus niger C15菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：2%桔皮粉、6%豆粕粉，250mL三角瓶中裝料30mL，接種量3%，最適初始pH為5.0，30℃條件下培養(yǎng)100h，產(chǎn)酶量可達(dá)1395.9U/mL。與原始產(chǎn)酶條件相比，產(chǎn)酶量提高8.6%。不同的金屬離子對產(chǎn)酶有不同的作用，添加適量的K2HPO4、MgSO4對產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，CuSO4、FeSO4對產(chǎn)酶起抑制作用。

柚苷酶，黑曲霉，條件優(yōu)化

就柑桔汁而言，產(chǎn)品出現(xiàn)的過度苦味是柑桔加工業(yè)所面臨的嚴(yán)重問題[1-3]。柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的一組復(fù)合酶系[4]，能水解柑桔中的主要苦味物質(zhì)柚皮苷成為無苦味的柚配質(zhì)、鼠李糖和葡萄糖[5]。最初柚苷酶是Hall[6]從芹菜種子中分離得到的，它能在一定條件下將柚皮苷分解而苦味消失。后來Ting S V[7]在一些利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶制劑中也發(fā)現(xiàn)并分離出這種酶，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)用這種酶處理柚子汁可導(dǎo)致其總黃酮的含量會明顯減少。胡奎等[8]從堆積腐爛柑桔的土壤中分離得到產(chǎn)柚苷酶的曲霉SN-90系，郭倩等[9]通過在腐爛的柚子皮上收集的天然菌株經(jīng)過分離初篩獲得產(chǎn)柚苷酶菌株。賴崇德等[10]則以桔皮粉作為唯一的碳源和氮源，從腐爛的桔皮上分離出一株產(chǎn)柚苷酶菌株A166，酶活力可達(dá)到955.6U/m L。由于酶法脫苦具有專一、高效、快速、對果汁風(fēng)味和營養(yǎng)成分無影響等特點(diǎn)，已成為目前最理想的脫苦方法[7，11-12]。但目前應(yīng)用酶法脫苦還存在著高產(chǎn)菌株缺乏、產(chǎn)酶效率低、成本高等問題。國內(nèi)還沒有工業(yè)化生產(chǎn)的商品柚苷酶制劑，只有日本等少數(shù)發(fā)達(dá)國家有工業(yè)化生產(chǎn)，而且價(jià)格昂貴，在生產(chǎn)實(shí)踐中使用進(jìn)口柚苷酶將會使企業(yè)生產(chǎn)成本大大增加。以上原因?qū)е妈周彰冈诟探凵罴庸ぶ械膽?yīng)用受到了極大的限制，因此篩選柚苷酶高產(chǎn)菌株、生產(chǎn)高品質(zhì)的柚苷酶商品酶制劑已成為當(dāng)務(wù)之急。本文以從自然界篩選得到的一株產(chǎn)柚苷酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger C15為出發(fā)點(diǎn)，較為系統(tǒng)地研究了接種量、發(fā)酵溫度、碳氮源、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時(shí)間等因素對菌株產(chǎn)柚苷酶的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)對C15菌株產(chǎn)柚苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在獲得柚苷酶發(fā)酵的最佳條件，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)柚苷酶提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉Aspergillus niger C15 本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得，酶活1285.6U/m L；柚皮苷（99.8%）、鼠李糖（99%） 鄭州荔諾生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2、CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、NH4H2PO4、MnSO4·4H2O

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；蛋白胨、酵母膏 上海市寶典化工有限公司；豆粕粉、麩皮、米糠、淀粉 市售；桔皮粉 自制，過80目篩，柚皮苷含量經(jīng)HPLC檢測約為6.3%。

全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；LC-20A液相色譜儀 SHIMADZU株式會社島津制作所；精密pH計(jì) 梅特勒-托利多公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基制備 豆渣（含水40%）10%，豆粕4%，葡萄糖2%，柚皮苷0.02%，自然pH，加水至1000m L，250m L三角瓶裝液量30m L，0.1MPa蒸汽滅菌20m in。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將菌種斜面孢子活化后制成1×106個(gè)/m L孢子懸液，然后接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，置于振蕩培養(yǎng)箱（30±1）℃培養(yǎng)3d。

1.2.3 粗酶液的制備 取搖瓶培養(yǎng)物1m L，以3000r/m in離心20m in，所得的上清液即為粗酶液。

1.2.4 柚苷酶酶活測定方法 取2m L 0.1%柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2mol/L、pH 4.0醋酸緩沖液1.9m L置于試管中，在40℃恒溫水浴中預(yù)熱4～5m in，然后加入粗酶液0.1m L，充分搖勻，準(zhǔn)確保溫30m in后，加熱至100℃使酶失活，離心取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，用液相色譜儀測定柚皮苷含量。柚苷酶活力的定義為：在溫度為40℃、pH 4.0條件下，每分鐘每毫升酶液分解柚皮苷的微克數(shù)[5]。

1.2.5 不同接種量對產(chǎn)酶的影響 分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%的接種量接種到搖瓶培養(yǎng)基中，以恒溫30℃、180r/m in的轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)。每個(gè)接種量進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.6 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響 以上述實(shí)驗(yàn)具有最高酶活的接種量接種到搖瓶培養(yǎng)基中，分別以20、25、30、35、40℃等不同的發(fā)酵溫度條件下，以恒溫30℃、180r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)。每個(gè)發(fā)酵溫度做三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.7 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 選擇葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麩皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖11種不同碳源以2%的添加量添加到搖瓶培養(yǎng)基中，以30℃、180r/m in搖瓶培養(yǎng)，每種碳源進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.8 不同氮源對產(chǎn)酶的影響 分別以豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）28種不同含氮物質(zhì)作為氮源分別以4%的添加量添加到搖瓶培養(yǎng)基中以30℃、180r/min的條件搖瓶培養(yǎng)，每種氮源進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.9 添加無機(jī)鹽的種類對產(chǎn)酶的影響 分別以0.1%的添加量添加CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO4到搖瓶培養(yǎng)基中充分溶解后于30℃、180r/min搖瓶培養(yǎng)，并以未加入上述無機(jī)鹽發(fā)酵液的酶活作為對照。每種無機(jī)鹽進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.10 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響 在搖瓶培養(yǎng)基組成和其他條件不變的情況下分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0在30℃、180r/m in條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每個(gè)pH進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。

1.2.11 裝液量對產(chǎn)酶的影響 分別將20、30、40、50、60m L不同量的液體培養(yǎng)基分別加入到250m L三角瓶中，在30℃、180r/m in條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，每個(gè)裝液量進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，72h后測酶活，取平均值。1.2.12 發(fā)酵時(shí)間的選擇 以1.2.5具有最高酶活的接種量接種到搖瓶培養(yǎng)基中，在溫度30℃、180r/min、自然pH條件下?lián)u床培養(yǎng)。每隔12h測發(fā)酵液酶活及水溶性蛋白含量。

1.2.13 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 選擇桔皮粉用量、豆粕粉用量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間作為因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種量對產(chǎn)酶的影響

不同接種量對產(chǎn)酶的影響見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)接種量較低時(shí)，酶活性較低，可能是由于所形成菌絲體密度不夠，不利于酶的生成；但當(dāng)接種量增加到5%時(shí)，酶活性也較低，則可能是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不能充分滿足菌體生長，導(dǎo)致形成的菌絲體較細(xì)小，同時(shí)散熱比較慢，所產(chǎn)生的廢氣也不易排出，不利于酶的形成。從圖1中可看出，當(dāng)接種量為3%時(shí)，發(fā)酵液中的酶活達(dá)到最高，與其他接種量差異極顯著，由此可確定，3%即為最合適的接種量。

圖1 不同接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of starter amounton naringinase productivity

2.2 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵系統(tǒng)中保持穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境是保證酶活性的重要條件。本實(shí)驗(yàn)研究了在20、25、30、35、40℃等不同的發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of temperature on naringinase productivity

由圖2可知，在溫度范圍20～30℃時(shí)，隨著溫度的升高，產(chǎn)酶活性迅速上升，當(dāng)溫度到達(dá)30℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值1156.4U/m L，與其他各個(gè)溫度差異較顯著，溫度偏高或偏低都不利于產(chǎn)酶。溫度升高，反應(yīng)速率加大，生長代謝快，生產(chǎn)期提前，但菌體容易衰老，發(fā)酵周期縮短，從而影響酶的最終產(chǎn)量。其次，溫度過高還可能導(dǎo)致柚苷酶性質(zhì)不穩(wěn)定甚至失活。溫度過低，繁殖周期加長，菌體總量較低，直接影響酶的產(chǎn)量。由此可確定，菌株的最適產(chǎn)酶溫度為30℃。

2.3 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

選擇11種不同碳源：葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麩皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖，添加到搖瓶培養(yǎng)基中，用量均為2%，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測發(fā)酵液中柚苷酶的活力。不同碳源對菌株產(chǎn)柚苷酶的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同碳源對菌株產(chǎn)柚苷酶的影響Fig.3 Effectof different carbon sources on naringinase productivity

從圖3可以看出，以桔皮粉和蔗糖+柚皮苷作為碳源最有利于產(chǎn)酶，葡萄糖+柚皮苷、鼠李糖次之，且與其他碳源差異極顯著?？赡苁怯捎谄咸烟切?yīng)的存在，以葡萄糖+柚皮苷作為碳源時(shí)的酶活較蔗糖+柚皮苷低。以麩皮、米糠、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖等作為單一碳源時(shí)，發(fā)酵液中柚苷酶的酶活很低，這說明柚苷酶在液態(tài)發(fā)酵條件下須在誘導(dǎo)物如柚皮苷的誘導(dǎo)下才能產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)柚皮苷的水解產(chǎn)物鼠李糖對柚苷酶的形成也有一定的誘導(dǎo)作用，但柚皮苷的誘導(dǎo)作用更好，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張晨等[13]的研究結(jié)果吻合。由此可見柚苷酶底物的誘導(dǎo)作用較產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。由于柚皮苷價(jià)格較昂貴，而桔皮粉是一種廉價(jià)易得復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)成分，除含有起關(guān)鍵誘導(dǎo)作用的柚皮苷外還含有豐富的糖類及少量有利于微生物生長的粗蛋白和礦質(zhì)元素，作為碳源不僅可以大大減少酶的生產(chǎn)成本，而且產(chǎn)柚苷酶與以蔗糖+柚皮苷作為碳源相當(dāng)，故選擇桔皮粉作為菌株產(chǎn)柚苷酶的最佳碳源。

2.4 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

研究表明，發(fā)酵過程中應(yīng)對氮源的種類和濃度進(jìn)行嚴(yán)格控制，盡量避免不適當(dāng)?shù)牡醇皾舛葘w生長和酶的形成產(chǎn)生負(fù)面影響。選擇8種不同氮源（豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2）分別添加4%到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測發(fā)酵液中柚苷酶的活力，結(jié)果見圖4。

圖4 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effectof various nitrogen sources on naringinase productivity

由圖4可以看出，在幾種不同的氮源中，以豆粕粉作為氮源時(shí)酶活最高，其次為硝酸銨和硫酸銨。其中豆粕粉是一種廉價(jià)易得的氮源，除含豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸外，還含有一些適合微生物生長繁殖的碳水化合物如低聚糖和大量維生素如維生素E等，另外還含有一些對產(chǎn)酶有明顯促進(jìn)作用的礦質(zhì)元素如Mg2+等，因此，選擇豆粕粉作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.5 添加無機(jī)鹽的種類對產(chǎn)酶的影響

選擇CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO49種無機(jī)鹽分別以0.1%的添加量添加到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定發(fā)酵液酶活，并以未加入上述無機(jī)鹽的發(fā)酵液的酶活作對照。結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所選擇的幾種無機(jī)鹽中，K2HPO4、MgSO4·7H2O兩種無機(jī)鹽則對產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用，可能是由于K+和Mg2+作為多種酶的激活劑，在酶與底物結(jié)合時(shí)起橋梁作用從而促進(jìn)了酶的產(chǎn)生；ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O對產(chǎn)酶有明顯的抑制作用，可能是由于Zn2+、Fe2+等金屬離子與酶結(jié)合后改變了酶的空間構(gòu)象，抑制了酶的活性，也可能是由于培養(yǎng)基中這幾種金屬離子濃度已能充分滿足菌體生長和產(chǎn)酶，額外添加則導(dǎo)致濃度過高從而抑制的酶的產(chǎn)生；CaCl2、NaNO3、NaCl和MnSO4·4H2O對產(chǎn)酶的影響不明顯。

表2 無機(jī)鹽種類對產(chǎn)酶的影響Table 2 Effectof inorganic salton the naringinase production

2.6 不同發(fā)酵液初始pH對產(chǎn)酶的影響

微生物在生長過程中會不斷地消耗碳源和氮源，同時(shí)也會造成培養(yǎng)基pH發(fā)生變化。而酶的產(chǎn)生需要一個(gè)合適的pH范圍。霉菌有著極強(qiáng)的繁殖能力[14]，對生長和產(chǎn)酶的pH范圍較寬，一般在3.0～8.5之間變動。在搖瓶培養(yǎng)基組成和其他條件不變的情況下用檸檬酸或氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基到不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液中柚苷酶的活力，不同初始pH對產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖5。

圖5 不同初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effectof initial pH on naringinase productivity

大多數(shù)菌種有維持其體內(nèi)細(xì)胞酸堿度在近中性條件的能力，有利于菌體進(jìn)行正常的新陳代謝。但發(fā)酵液的pH將會對菌株的產(chǎn)酶反應(yīng)有間接的影響。由圖5可以看出，在pH 3.0～5.0時(shí)，隨著pH的上升，酶活迅速增加；在pH 4.5～5.5范圍內(nèi)，酶活保持在較高水平，達(dá)1000U/m L以上，并在pH為5.0時(shí)達(dá)到最高峰，為1167.4U/m L，與其他pH差異較為顯著。由pH6.0～8.0，酶活呈下降趨勢。由此可見，pH偏高或偏低都不利于菌體產(chǎn)酶，因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為5.0。

2.7 裝液量對產(chǎn)酶的影響

分別將20、30、40、50、60m L不同量的液體培養(yǎng)基分別加入到250m L三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測發(fā)酵液中柚苷酶的活力。培養(yǎng)基占搖瓶體積比對產(chǎn)酶的影響見圖6。

圖6 不同裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effectof differentmedium contained in flask on naringinase productivity

由圖6可知，250m L三角瓶中裝液量為30m L時(shí)，柚苷酶酶活最高，為1146.3U/m L。由此可見，該菌株產(chǎn)柚苷酶對培養(yǎng)基中氧含量要求較高，隨著裝液量的上升，酶活開始下降，這可能是由于裝液量過多導(dǎo)致?lián)u瓶內(nèi)的剩余空間變小，培養(yǎng)基中的溶氧量相應(yīng)減少，抑制了菌絲體的生長和酶的形成。當(dāng)裝液量小于30m L時(shí)，酶活較高，但在實(shí)際操作中若裝液量過少，如小于20m L時(shí)，不便于粗酶液的提取而且導(dǎo)致效率降低，生產(chǎn)成本增加。綜合考慮以上因素，本實(shí)驗(yàn)選取最適裝液量為250m L三角瓶裝液量30m L。

2.8 發(fā)酵時(shí)間的選擇

將所篩選菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并在發(fā)酵過程中不同時(shí)間取樣，測定發(fā)酵液中的柚苷酶的活力和水溶性蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵液的變化情況見圖7。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effectof fermentation time on naringinase productivity

由圖7可知，菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)酶，柚苷酶活性的高峰出現(xiàn)時(shí)間為連續(xù)培養(yǎng)100h前后，酶活達(dá)1123.2U/m L，此時(shí)水溶性蛋白含量也達(dá)到了最高，為0.41mg/g，說明菌體也獲得了最大限度的生長。本實(shí)驗(yàn)以取得最大產(chǎn)量的柚苷酶為目標(biāo)，因此發(fā)酵周期定為100h，可得到最佳產(chǎn)柚苷酶活力。

2.9 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。對表3進(jìn)行直觀分析發(fā)現(xiàn)，組合2即A1B2C2D2柚苷酶活力最高。從極差值R看出：各因素影響柚苷酶活力主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞豆粕粉用量＞發(fā)酵時(shí)間＞桔皮粉用量。綜合分析發(fā)現(xiàn)，A1B3C2D2為最優(yōu)培養(yǎng)基組成，即桔皮粉2%、豆粕粉6%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為100h菌株產(chǎn)柚苷酶能力最佳。利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，各個(gè)因素的顯著性順序依次為：C＞B＞D＞ A，因素B、C、D均達(dá)到了顯著水平（p＜0.05），A因素的作用不顯著。由于A1B3C2D2組合不在實(shí)驗(yàn)之列，故需要再進(jìn)一步作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表3 正交試驗(yàn)表L9（34）Table 3 L9（34）orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Resultof orthogonal experiment variance analysis

2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合A1B3C2D2，即桔皮粉2%、豆粕粉6%，發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為100h（培養(yǎng)基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，接種量為3%，發(fā)酵液初始pH為5.0，250m L三角瓶中裝液量為30m L）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行做三份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為1397.2、1408.5、1382.1U/m L，三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的柚苷酶活力平均值1395.9U/m L較表3中酶活力值最高的組合2即A1B2C2D2有小幅度提高，說明該最優(yōu)組合工藝合理可行。

3 結(jié)論

采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，對柚苷酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了Aspergillus niger C15菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件，其組成為：2%桔皮粉、6%豆粕粉，培養(yǎng)基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，250m L三角瓶中裝料30m L，接種量3%，最適初始pH為5.0，30℃條件下培養(yǎng)100h，產(chǎn)酶量可達(dá)到1395.9U/m L。與優(yōu)化前產(chǎn)酶條件相比，產(chǎn)酶量提高8.6%。通過實(shí)驗(yàn)充分證明了不同的金屬離子對產(chǎn)酶具有不同的作用，適量添加K2HPO4、MgSO4·7H2O對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，而ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O則對產(chǎn)酶起抑制作用，生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免使用含有此類對產(chǎn)酶產(chǎn)生抑制作用離子的容器。

[1]勵建榮，梁新樂，王向陽，等.柑橘類果汁脫苦技術(shù)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，26（1）：55-58.

[2]張晨，劉志偉.柑橘類果汁的脫苦[J].江蘇食品與發(fā)酵，2000（1）：26-28.

[3]孫蘭萍.柑橘類果汁苦味物質(zhì)的脫除研究[J].食品工業(yè)科技，2003，24（1）：97-100.

[4]IMagario，A Neumann，EOliveros，etal．Deactivation kinetics and response surface analysisof the stability ofα-L-rhamnosidase from penicillium decumbens[J]．Appl Biochem Biotechnol，2009，152：29-41．

[5]汪釗，毛富根．柚苷酶產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵條件研究[J]．微生物學(xué)報(bào)，1995，22（1）：18-22．

[6]Hall，Donald H.A new enzyme of the glycosidase type[J]. Nature，1938，3586（142）：150.

[7]王志國.微生物與柑桔汁脫苦[J].食品科學(xué)，2000（11）：10-14.

[8]胡奎，李幫秀，吳珍齡.柚苷酶產(chǎn)生菌的選育[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：141-143.

[9]郭倩，鄔應(yīng)龍，黃高凌，等.柚苷酶產(chǎn)生真菌的復(fù)篩及菌種初步鑒定[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：225-228.

[10]賴崇德，蔡華靜，夏海林，等.一株產(chǎn)柚苷酶菌株黑曲霉的分離及菌種鑒定的初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（5）：759-763.

[11]汪釗，毛富根.柚苷酶固體發(fā)酵及消除桔子汁苦味的研究[J].食品科學(xué)，1996，17（6）：17-19.

[12]鄭育仁.柑橘類果汁脫苦技術(shù)的研究[J].漳州職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003（2）：110-112.

[13]張晨，劉志偉，鄭彥彤，等.產(chǎn)柚苷酶菌株B04的分離及產(chǎn)酶特性研究[J].工業(yè)微生物，2007，37（5）：38-41.

[14]霉菌[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/36020.htm.

Study on the optimum fermentation conditions of
Aspergillus niger C-15 for the production of naringinase

LIZhi-jian1，TAN Xing-he2，LIGao-yang1
（1.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China；
2.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

The fermentation cond itions for Aspergillus niger C15 naringinase p roduc tion were op timalized by orthogonal experiment.The experimental result ind icated that the best fermentation conditions was as follows：2%citrus peelmealand 6%soybean meal，30m L culture media in 250m L beaker flask，3%inoculation amount，initial pH 5，incubation tem perature 30℃，time 100h.Under these op tim ized cond itions，the yielding capacity of naringinase by the mutant was 1395.9U/m L，which was increased by 8.6%com pared w ith the initial level（1285.6U/m L）.Proper quantity of K2HPO4and MgSO4could imp rove naringinase p roduction，CuSO4，F(xiàn)eSO4were bad for p roducing enzyme.

naringinase；Aspergillus niger；op tim ization

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0229-05

2012－01－05

李志堅(jiān)（1977-），男，碩士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA10Z307）。