保加利亞乳桿菌關鍵糖代謝機制的研究

孫懿琳，田 輝，方 偉，霍貴成

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150030）

保加利亞乳桿菌關鍵糖代謝機制的研究

孫懿琳，田 輝，方 偉，霍貴成*

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150030）

以五株德氏乳桿菌保加利亞亞種為出發(fā)菌株，通過高效液相色譜法對四株后酸化強弱不同的保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸奶中葡萄糖、乳糖、半乳糖及乳酸的含量進行測定，通過Carrez法處理沉淀蛋白，采用Aminex HPX 87H色譜柱，5mmol/LH2SO4溶液為流動相，流速0.6mL/min。結果表明，本實驗中保加利亞乳桿菌室溫貯存過程中產乳酸的途徑為乳糖到葡萄糖，葡萄糖通過糖酵解生成乳酸，生成的半乳糖不被利用，一直處于累積狀態(tài)；后酸化強的菌株代謝乳糖和葡萄糖的含量比后酸化弱的菌株代謝量更高，乳糖代謝途徑為菌株貯存期產酸關鍵途徑。

保加利亞乳桿菌，發(fā)酵乳，糖代謝，后酸化，高效液相色譜

保加利亞乳桿菌是酸奶發(fā)酵劑中重要的菌種之一，也是導致后酸化現(xiàn)象發(fā)生的主要菌種，如果能夠篩選出自然狀況下的質量優(yōu)良的弱后酸化保加利亞乳桿菌，使其在酸奶發(fā)酵時正常產生乳酸，而在低溫貯存過程中具有較弱的產酸能力，可從根本上解決酸奶后酸化問題[1]。目前通過改善工藝水平控制后酸化的方法很多，但都不能從根本上解決后酸化問題[2]，而誘變育種及基因工程的遺傳穩(wěn)定性受到多因素影響和制約[3-4]。我國擁有豐富的乳酸菌資源，且擁有年銷售額上百億的酸奶市場，完全可以不斷篩選出更好的功能性菌株，這是解決酸奶后酸化的長遠大計。酸乳發(fā)酵菌種主要包括德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜熱鏈球菌，研究表明，此二株菌對乳糖的代謝方式為同型乳酸發(fā)酵，乳糖經透膜酶被轉運到細胞內，經β-半乳糖苷酶催化，產生葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經糖酵解途徑生成乳酸和三磷酸腺苷；而半乳糖不被利用，被排除細胞外[5-6]。RobertW Hutkins等[7]認為乳糖與半乳糖通過反向轉座子運輸，來維持乳酸菌的新陳代謝平衡。研究德氏乳桿菌保加利亞亞種的糖代謝機制，對于開發(fā)一種弱后酸化的酸乳發(fā)酵劑具有重要意義。本文主要目標是從實驗室菌株中篩選出天然的弱后酸化保加利亞乳桿菌，采用高效液相色譜法利用Am inex HPX 87H分析柱對菌株在代謝乳糖，半乳糖和葡萄糖量的測定和對比中，找出酸奶貯藏過程中菌株可以通過哪些途徑代謝糖產酸，找出酸奶貯藏過程中菌株代謝糖產酸的關鍵途徑，從而為有針對性的控制酸奶后酸化問題，為直投式弱后酸化酸奶發(fā)酵劑的制備提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 實驗菌株為德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS-1.0207、KLDS-1.1009、KLDS-1.1005、KLDS-1.1006、KLDS-1.1011，自行從弱后酸化商業(yè)發(fā)酵劑中分離的保加利亞乳桿菌命名為G-495；培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基和11%（w·v-1）脫脂乳培養(yǎng)基；乳糖、葡萄糖、半乳糖和乳酸 Sigma公司，色譜純；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅和冰乙酸等其他化學試劑 均為分析純。

Delta 320精密pH計 Mettler Toledo公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；HPLC Waters 2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Aminex HPX 87H分析柱（300mm×7.8mm，9μm） 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 弱后酸化菌株的篩選 a.初篩：將15株實驗室菌株以3%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，每隔2h取樣，測定pH，OD600nm，從中篩選出生長速度差異較大的菌株。

b.復篩：將生長速度差異較大的菌株接種至11%的脫脂乳中，做單菌發(fā)酵實驗，檢測菌株在4℃貯存過程中的后發(fā)酵能力，從中篩選出后酸化強弱差異較大的菌株。

c.對照菌株：自行從商業(yè)發(fā)酵劑中分離出的菌株G-495為弱后酸化保加利亞乳桿菌，不經過篩選，直接作為后期糖代謝實驗的標準對照菌株。

1.2.2 脫脂乳發(fā)酵酸奶的制作 將活化好的保加利亞乳桿菌以5×106cfu/m L的接種量接入11%脫脂乳中充分混勻、迅速分裝至無菌小燒杯中，于42℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，待pH達到4.5，立即終止發(fā)酵，4℃后熟24h，將發(fā)酵乳移至25℃培養(yǎng)箱，加速后酸化，貯藏10d。

1.2.3 低溫貯存過程中酸度的測定[8]測定單菌發(fā)酵的酸奶在4℃貯存過程中酸度的變化情況。滴定酸度采用GB 5413.34-2010，pH測定方法采用Delta 320精密pH計直接測定。

1.2.4 室溫后酸化貯存過程中乳糖、葡萄糖、半乳糖和乳酸的測定[9-10]采用高效液相色譜技術對保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵乳在25℃貯存下，1、4、10d的葡萄糖、乳糖、半乳糖及乳酸含量進行高效液相色譜分析，每組三個平行。

樣品處理：采用Carrez法對樣品進行處理。稱取均勻保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵乳樣品5.0000g（精確至0.1mg），加25g水溶解，緩慢加入CarrezⅠ溶液和CarrezⅡ溶液各2.5m L，加水使溶液質量為50.0000g（精確至0.1mg），磁力攪拌30m in，放置室溫后5000r/m in離心15m in，獲上清液并用0.22μm微孔濾膜過濾以去除蛋白及細菌菌體，－20℃保存。其中CarrezⅠ溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，加水溶解至100m L；CarrezⅡ溶液：稱取21.9g乙酸鋅加3m L冰乙酸，加水溶解并稀釋至100m L[13]。

機器參數(shù)：Bio-Rad Aminex HPX 87H（300mm× 7.8mm，9μm）色譜柱，RID214示差折光檢測器，5mmol/L H2SO4流動相，流速0.6m L/m in，溫度為65℃，進樣量10μL，每個樣品檢測時間13m in。

標準曲線的繪制：用流動相為溶劑，精確配制葡萄糖為0.5～2.5mg/m L，乳糖為4～12mg/m L，半乳糖為1～5mg/m L，乳酸為2.5～7.5mg/m L，用0.22μm濾膜過濾于樣品瓶中，以標準品含量（mg/m L）為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 弱后酸化菌株

2.1.1 初篩 從15株實驗室菌株中篩選出5株生長速度差異較大的菌株。生長曲線如圖1所示。

圖1 五株菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of the five strains

圖2 五株菌的pH變化曲線Fig.2 pH curve of the five strains

菌株的生長速度與菌株的代謝和產酸有直接關系，菌株較低的生長能力也導致了其較弱的產酸能力，所以將生長速度作為篩選弱后酸化菌株的第一個標準。由圖1、圖2可知，菌株24h的產酸情況與細胞密度一致，其中生長較快的菌株24h后的pH達到3.9～4.1，光密度值（OD600）為1.6～1.8；而生長較慢的菌株pH為4.3～4.6，光密度值（OD600）僅為0.8～1.0，這是因為H+-ATPase活性可以調節(jié)德氏乳桿菌保加利亞亞種的能量代謝和菌株自身的生長，生長較慢的菌株可能是由于其H+-ATPase較弱，使得底物磷酸化水平較低[11]，因此ATP的產量也隨之減少，導致了菌株的低生長率和弱產乳酸能力[12]。經過初篩后，從實驗室菌株中篩選出生長速度慢的菌株KLDS-1.1006、KLDS-1.1011和KLDS-1.1004，生長速度快的菌株KLDS-1.0207和KLDS-1.1009。

2.1.2 復篩 從5株生長速度差異較大的菌株中篩選出2株弱后酸化菌株，并以1株后酸化較強的菌株作為對照菌株，酸度變化曲線如圖3所示。

圖3 貯存期間三株菌的滴定酸度變化曲線Fig.3 Acidity curve of the three strains in the storage duration

Donkor[13]認為高質量的酸奶在消費者消費時，其pH應為4.2～4.3，國標GB 19302-2010對酸奶及其制品規(guī)定：酸度為≥70°T（乳酸度為≥0.63）。由圖3、圖4可知，三株生長速度相差很大的實驗室菌株的后酸化程度差異很大，KLDS-1.0207在貯存13d后發(fā)生了嚴重的后酸化，pH達到4.15，滴定酸度達到110°T，而兩株生長速度緩慢的菌株KLDS-1.1006和KLDS-1.1011在貯存期間pH變化趨勢平緩，在貯存13d后，pH仍能維持在4.5左右，滴定酸度在86～89°T之間，增長量不足10°T。故經過復篩后，篩選出KLDS-1.1006和KLDS-1.1011為野生弱后酸化保加利亞乳桿菌。

圖4 貯存期間三株菌pH變化曲線Fig.4 pH curve of the three strains in the storage duration

2.2 乳糖、葡萄糖、半乳糖和乳酸的含量分析

2.2.1 標準曲線 標準樣品的回歸方程、相關系數(shù)見表1，由表1可知各組分的質量濃度0.5～12mg/m L與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)在0.9997～0.9999之間，可見，標準曲線具有較高精確度，符合定量要求。

表1 標準曲線的線性Table 1 The linearity of standard curve

2.2.2 混合標準品及樣品高效液相色譜圖 葡萄糖和半乳糖互為手性同分異構體，一般色譜技術很難將它們分開，但是離子交換樹脂柱Aminex HPX 87通過離子調節(jié)分配層析技術分離不同化學特性的混合物，可以很好地分離各種糖類物質并準確定量[14]，本實驗采用Am inex HPX 87分離柱很好地將兩者分開?；旌蠘藴势飞V分離圖見圖5。

圖5 乳糖、葡萄糖、半乳糖標準樣品的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram ofmixed sugar standards

本實驗中選取Carrez法處理樣品，方法簡單快速，能消除雜質對樣品的潛在影響，排除干擾能力強；不同的流速和柱溫對樣品分離時間會有很大影響[15]，本實驗中樣品分離時間僅為13min，能很好得將葡萄糖和半乳糖分開。樣品分離圖見圖6。

圖6 Carrez法處理樣品后的色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of fermented milk

2.2.3 乳糖、葡萄糖、半乳糖和乳酸的含量分析 因為要找出乳酸菌代謝乳糖產酸的關鍵途徑，所以需測定各菌株的糖和酸在貯藏期的變化，找出后酸化強弱不同的菌株對關鍵糖代謝量的差別，所以對受試菌株的選擇和測定天數(shù)是很重要的。本實驗選取25℃為貯存溫度，可以更快更明顯的反映出菌株的后酸化能力，而菌株在0～2d貯存中的pH下降極快，在第4d是真正決定后酸化強弱的關鍵一天[16]，故本實驗分別測試在25℃貯藏第1、4、10d發(fā)酵乳中的葡萄糖、半乳糖、乳糖和乳酸的量，表2～表4為根據(jù)HPLC對各菌株代謝糖產酸量的結果，分別計算出各菌在1～4d和1～10d內的乳糖代謝量，半乳糖的積累量及乳酸的生成量。

由表2～表4可知，菌株貯存過程中的糖代謝與產酸是完全相對應的，即消耗乳糖量越多，生成乳酸量則越多；其中前4d的糖代謝量較大，乳糖消耗量和半乳糖的積累量均占10d內整體消耗量的大部分，尤其是對于后酸化弱的菌株來說，前4d的乳酸生成量與前10d的乳酸生成量相差不大，這進一步證明了前4d是貯存期菌株產酸的關鍵時期；在貯存后期（6～10d），后酸化弱的菌株糖代謝率低，產酸緩慢；后酸化強的菌株則繼續(xù)快速代謝糖產酸。

表2 高效液相色譜法（HPLC）測定單菌發(fā)酵酸奶中乳糖含量Table 2 Changes in lactose contents in fermented milk during storage as determined by the HPLCmethod

表3 高效液相色譜法（HPLC）測定單菌發(fā)酵酸奶中半乳糖含量Table 3 Changes in galactose contents in fermented milk during storage as determined by the HPLCmethod

表4 高效液相色譜法（HPLC）測定單菌發(fā)酵酸奶中乳酸含量Table 4 Changes in lactic acid contents in fermented milk during storage as determined by the HPLCmethod

在乳糖酶存在的情況下，乳糖的水解伴隨著半乳糖的釋放，其中，葡萄糖通過類似于PTS系統(tǒng)轉運，乳糖和半乳糖通過通透酶系統(tǒng)轉運[17]。Terence Thomas、Vaughan Crow和Rob Hutkins均曾報道過嗜熱鏈球菌自發(fā)突變株可以在半乳糖作為唯一碳源的環(huán)境中生長，而其他大多數(shù)的乳酸菌均只能代謝乳糖和葡萄糖[18]，菌株不能利用半乳糖，部分原因可能是其不能合成調節(jié)Leior途徑的足夠數(shù)量的半乳糖激酶，另一方面也可能是由于乳糖-半乳糖的反向轉座子運輸競爭抑制了半乳糖激酶的酶活[19]。本實驗結果中半乳糖從貯存開始就一直在積累，隨著時間的延長，半乳糖的含量逐漸增多，這也和Robert等認為的保加利亞乳桿菌選擇性代謝半乳糖的觀點是一樣的[5-7]；乳酸菌產酸的另一個關鍵就是葡萄糖經糖酵解途徑生成乳酸，葡萄糖反應的量應等于乳酸生成的量，而本實驗中并未檢測到葡萄糖的含量，這是因為葡萄糖經乳糖水解生成后，立即通過EMP途徑瞬間轉化而不會排放到胞外，因此含量極低未到HPLC檢出限[20]，這和很多研究者認為的貯存過程中葡萄糖的量極低或者根本檢測不出來[21-22]是一致的，其中Richmond[14]研究表明發(fā)酵乳貯藏至50d才可檢測到葡萄糖且痕量。

碳源迅速有效的利用是快速產酸、pH急劇下降的主要因素[23]。后酸化強的菌株KLDS-1.0207代謝乳糖量和半乳糖積累量遠遠超過了后酸化程度弱的KLDS-1.1006和G-495，而后酸化較弱的KLDS-1.1001代謝乳糖量和半乳糖積累量均較低，可見菌株表現(xiàn)出來的后酸化差異與它們的乳糖代謝有直接關系。A lm[24]研究表明，在貯存11d的酸奶制品中，乳糖含量從最初的非發(fā)酵乳中4.8g/100g降低到酸奶中的2.3g/100g，而半乳糖則由原來的微量增加到發(fā)酵結束后的1.3g/100g；李琦[10]報道，嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳室溫貯存10d后，乳糖含量從新鮮酸乳的50.01mg/m L下降至42.93mg/m L，而本實驗中四株保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵乳在25℃貯存10d后，乳糖的含量分別降低了35%～43%，半乳糖的含量分別增加了26%～35%（和第一天相比），理論上乳糖的吸收量和半乳糖的釋放量是在同等摩爾下進行的[25]，但從我們的實驗結果來看，生成的半乳糖的量并不是乳糖消耗量的一半，這是因為還有一部分細胞內的半乳糖沒有被測出來的原因。

由實驗結果可以得出，乳糖經β-半乳糖苷酶代謝分解這一步對于貯藏過程中保加利亞乳桿菌代謝產酸來講尤為重要，同時糖代謝結果進一步驗證了本實驗中篩選出的菌株KLDS-1.1006和KLDS-1.1001是弱后酸化菌株。

3 結論

3.1 低溫貯存期間，由于乳中的乳酸菌可繼續(xù)代謝乳糖產酸，導致酸度增加，使產品出現(xiàn)消費者不可接受的過酸味及其他感官質量下降的現(xiàn)象，目前控制后酸化的方法較多，雖有一定效果，但成本均較高。本實驗中篩選出的天然弱后酸化菌株KLDS-1.1006及KLDS-1.1011，性狀穩(wěn)定，生產上操作簡單，可降低成本，且貯存期間pH緩慢下降，可保證乳制品酸味適中，口感良好，符合消費者的需求，擁有廣闊的市場前景。

3.2 通過高效液相色譜法測定出保加利亞乳桿菌單菌發(fā)酵乳在后酸化貯存中產酸關鍵途徑為乳糖到葡萄糖，葡萄糖通過糖酵解在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，其并不能利用半乳糖；本實驗中后酸化強的菌株代謝乳糖和葡萄糖的含量比后酸化弱的菌株代謝量均高，可見，菌株的糖代謝量與產酸多少有直接的關系，即糖代謝量多，產酸多，后酸化強，故可通過檢測糖代謝量來判斷菌株的后酸化強弱。通過確定的菌株代謝糖產酸的關鍵途徑，可為進一步解決酸奶后酸化問題提供理論指導。

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Study on the key glycometabolism of Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus

SUN Yi-lin，TIAN Hui，F(xiàn)ANG W ei，HUO Gui-cheng*
（Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Five Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains were regarded as the research sub ject，an HPLC method for the determ ination of lactose，g lucose and galactose in fermented m ilk was estab lished. Proteins from sam p les were p recipitated w ith Carrez reagent.The chromatog raphic separation was achieved on an Am inex HPX 87H column using 5mmol/L H2SO4as mobile phase at a flow rate of 0.6m L/m in.Results demonstrated that the metabolism of Lac tobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus was from lac tose to g lucose，the latter would be transferred into lactic acid，they had inability to uilize galac tose.The strains which had strong ability of metabolizing g lucose and lactose also showed serious postacidification.The metabolic pathway from lactose to lactic acid was the crucial fac tor that results in postacid ification of yogurt.

Lactobacillus delb rueckiisubsp.bulgaricus；fermented m ilk；g lycometabolism；postacid ification；high p ressure liquid chromatog raphy（HPLC）

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0202-05

2012－05－21 *通訊聯(lián)系人

孫懿琳（1987-），女，碩士研究生，研究方向：乳品科學與工程。

教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目（IRT0959）；國家自然基金項目（31171717）。