反膠束萃取α-淀粉酶動力學分析

張建國，陳曉明，熊雙麗，錢會芳

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

反膠束萃取α-淀粉酶動力學分析

張建國，陳曉明，熊雙麗，錢會芳

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

利用恒界面池，在雙膜理論基礎上建立了CTAB-異辛烷-正丁醇反膠團體系萃取α-淀粉酶的動力學模型?？疾炝瞬煌鹗济富顫舛?、攪拌轉速、pH、液相離子強度以及表面活性劑和助表面活性劑濃度對α-淀粉酶萃取表觀傳質(zhì)系數(shù)kL的影響并對利用改變恒界面大小在判斷傳質(zhì)控制機理方面進行了探討。結果表明，起始酶活濃度在1105U·L-1到4420U·L-1條件下，殘酶濃度對萃取時間常用對數(shù)曲線為一直線且斜率恒定，表明該動力學方程能夠較好地描述α-淀粉酶萃取過程且與初始酶活濃度在無關；攪拌轉速、水相pH、水相離子強度、表面活性劑和助表面活性劑濃度對萃取過程中α-淀粉酶表觀傳質(zhì)系數(shù)kL都有影響，從而改變傳質(zhì)的機制。在規(guī)定的條件下，萃取速率對恒界面相對斜率隨著pH增加而減小，當pH為9.9、10.8、11.9時，萃取過程分別以界面控制、混合控制、擴算控制為主，由此可見傳質(zhì)速率對恒界面大小變化相對斜率可以表征界面控制的影響程度。

α-淀粉酶，反膠束萃取，動力學，表觀傳遞系數(shù)（kL）

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）屬于淀粉內(nèi)切型水解酶，廣泛的應用在發(fā)酵、食品、紡織、制革、醫(yī)藥工業(yè)、石油開采、輕化工等行業(yè)，是世界應用量最大的工業(yè)酶制劑之一[1]。目前，工業(yè)上對α-淀粉酶的提取主要有兩種方法：一種是用硫酸銨直接沉淀；另一種是絮凝-超濾-乙醇沉淀法[2]。由于α-淀粉酶在不同行業(yè)的使用對α-淀粉酶的質(zhì)量要求不同以及提取物料的物理化學性質(zhì)限制了提取方法的高效應用。20世紀70年代提出反膠束可提取酶蛋白后，國內(nèi)外利用反膠團萃取蛋白酶均有大量報道[3]。近年來，反膠束萃取仍是研究熱點[4-6]，在α-淀粉酶的反膠團萃取方面主要集中在工藝條件優(yōu)化方面[7-10]，但利用動力學考察萃取條件對萃取過程的影響方面鮮見報道。萃取動力學研究是深入了解萃取過程的有效手段，可以深入了解萃取過程的機制。由于反膠團萃取蛋白質(zhì)機理復雜且研究歷史較短，目前反膠團萃取研究過程仍處于半理論半經(jīng)驗的階段[10]，加強對反膠團動力學過程的研究，有利于對萃取條件進行有效控制，在萃取設備的選型和設計方面有著重要的意義[11]。混合澄清槽、恒界面池是研究反膠團動力學過程常用的手段之一[12-13]，在對酶進行反膠團萃取過程中，主要有混合澄清槽和恒界面池法?；旌铣吻宀劢恿W模型多用于研究萃取條件對萃取體積傳質(zhì)系數(shù)和萃取率的影響；恒界面池法建立的動力學方便研究萃取條件對傳質(zhì)系數(shù)和萃取速率的影響，較混合澄清槽建立的動力學更有利于對萃取機制的研究。Matthijs Dekker等[14]利用恒界面池建立動力學模型對影響α-淀粉酶反膠團萃取傳質(zhì)速率進行了探討，其后利用動力學對α-淀粉酶反膠團萃取的研究鮮見報道。本文利用恒界面法，以CTAB-異辛烷-正丁醇反膠束體系萃取α-淀粉酶為研究對象，利用“雙膜傳質(zhì)”理論為基礎，建了α-淀粉酶傳遞的動力學模型。研究了水相pH、離子強度、無機相中α-淀粉酶濃度、攪拌強度等操作條件對α-淀粉酶物質(zhì)表觀傳遞系數(shù)的影響。為深入了解α-淀粉酶在該體系下萃取過程的機理、為萃取過程的優(yōu)化和開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CTAB 國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇成都市科龍化工試劑廠；異辛烷 成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉、碘化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；碘、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 中國醫(yī)藥（集團）上海試劑公司；氯化鈉 上海試四化工有限公司；以上試劑均為分析純；可溶性淀粉 江蘇徐州試劑二廠；鹽酸 宜興市化學試劑總廠中國醫(yī)藥（集團）上海試劑公司；α-淀粉酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；粗α-淀粉酶商品經(jīng)過透析，Sephadex G-100層析柱并經(jīng)過SDS-PAGE（8%分離膠）檢驗確認為電泳純。

TG328A型分析天平 上海天平儀器廠；3K15臺式冷凍離心機 德國SIGMA公司；UV-2100分光光度計 尤尼可（上海）儀器有限公司；GZX-9246MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；AB204-N電子天平 上海第二天平儀器廠；YNK220-A永磁直流電機 尤尼可（上海）儀器有限公司；PHS-3TC（0.01級）精密數(shù)顯酸度計 上海天達儀器有限公司；CU600電熱恒溫水浴鍋 杭州齊威儀器有限公司。

1.2 恒界面實驗裝置

自制反膠束萃取動力學實驗恒界面裝置如圖1所示，玻璃筒型容器（?108.2mm）裝有寬度為20.1mm的四塊擋板和直徑為30.08mm的上下攪拌槳以及間距為8mm的多孔界面板以及可調(diào)劑的界面環(huán)，攪拌軸直徑為7mm。攪拌槳在數(shù)字可調(diào)速電機的帶動下進行攪拌，恒溫控制在恒溫水浴鍋中進行。

圖1 恒界面實驗裝置Fig.1 Structure of constant interface cell

式中：n為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應時間（min）；V為酶液體積（m L）；10為可溶性淀粉液的體積（m L）；△y為被水解的可溶性淀粉溶液的濃度。

1.3.2 恒界面池操作和萃取條件 在恒界面池中先加入一定體積的不含α-淀粉酶的水相至界面環(huán)中央，再加入一定體積的水飽和有機相，靜止分層明顯后根據(jù)實驗要求利用帶長針管的注射器向水相中注入少量α-淀粉酶溶液，啟動轉速已設定的攪拌器，同時計時，在規(guī)定時間內(nèi)取樣分析水相中α-淀粉酶活力變化，有機相中酶活變化利用差減法計算。

萃取沒有特別說明條件下，有機相異辛烷-正丁醇（體積比為4∶1），CTAB為0.02g·m L-1；無機相氯化鈉濃度為0.03mol·L-1，pH 11.9；攪拌速度N=250r·m in-1，萃取溫度為40℃；有機相和無機相同為450m L，比恒界面S=A·V-1=0.174cm-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 淀粉酶活力測定-吸光光度法 取10m L 2%的淀粉溶液，加入2m L pH 6.0磷酸鹽緩沖液，60℃預熱10m in，加入取1m L待測酶液，搖勻，60℃準確反應5min，立即加入2m L 0.2%的鹽酸終止反應。取出0.5m L終止反應液，加入10m L碘液，搖勻，測定其620nm時吸光值，并根據(jù)標準曲線換算為質(zhì)量濃度。60℃、pH 6.0的條件下，每毫升酶液每m in水解可溶性淀粉的毫克數(shù)，為一個酶活單位（U）。

2 結果與討論

2.1 反膠團萃取動力學過程建立

CTAB-異辛烷-正丁醇反膠束體系萃取α-淀粉酶過程假定為：α-淀粉酶在水相中擴散至界膜；在界膜靠近水相一側與進入空反膠束形成含α-淀粉酶反膠束，含α-淀粉酶反膠束在界面中擴散至靠近有機相一側界膜；α-淀粉酶反膠束通過擴散進入有機相。α-淀粉酶界膜傳質(zhì)過程和界面層化學反應類似，當擴散速率遠遠大于界膜傳質(zhì)速率時，萃取過程由界面控制；當界面?zhèn)髻|(zhì)速率遠遠大于擴散速率時，萃取過程由擴散速率控制；當界面?zhèn)髻|(zhì)速率與擴散傳質(zhì)速率相當時，萃取過程由混合控制。假定CTAB-異辛烷-正丁醇反膠束體系萃取α-淀粉酶萃取過程符合雙膜理論，則α-淀粉酶萃取速率與通過界面?zhèn)髻|(zhì)速率相等；在前期萃取過程中α-淀粉酶活力濃度在一定范圍內(nèi)表觀傳質(zhì)系數(shù)（kL）為恒定值，于是α-淀粉酶進入反膠束相傳遞通量可由下式表示：

在萃取過程中根據(jù)物料平衡可得

將（3）式代入（2）式并積分得

式中：A為恒界面池界面積（m2）；c為α-淀粉酶活力單位（U·m L）；H為萃取的分配系數(shù)；V相體積（m3），上角標0為初始值，下角標o、w分別為有機相和無機相。

2.2 初始水相淀粉酶濃度對萃取的影響

在規(guī)定條件下，改變初始水相中α-淀粉酶活濃度，制定ln[（1-D）/（E-D）]隨時間變化曲線，結果見圖2。

圖2 不同α-淀粉酶活濃度下，ln[（1-D）·（E-D）-1]與時間t的關系Fig.2 Relation of ln[（1-D）·（E-D）-1]with time at differentα-amylase concentration

從圖2可以看出，ln[（1-D）/（E-D）]與時間t呈直線關系，在不同α-淀粉酶初始酶活濃度下其斜率B= kLAV-1（1+H）H-1基本不變。在該實驗條件下A、V、H為定值，kL為測定值，通過斜率可以得知kL不隨濃度的變化而變化?？梢?，利用雙膜理論建立的該方程描述萃取過程是可行的，通過曲線直線化求取動力參數(shù)kL是可信的，而且kL與起始水相中α-淀粉酶活力濃度無關。

2.3 不同pH、N、離子強度對kL的影響

根據(jù)雙膜理論，傳遞過程膜的阻力與液體流動速度相關，起始攪拌轉速設置由50r·min-1逐步提高攪拌轉速當達到300r·m in-1時，界面振蕩出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，故最高轉速設定為250r·m in-1。通過B=kLAV-1（1+ H）H-1計算kL并繪制不同NaCl濃度、pH條件下，不同攪拌強度N對傳質(zhì)系數(shù)kL的影響，結果見圖3、圖4。

2.3.1 不同條件下N對kL的影響 從圖3、圖4可知，分別在低pH和高鹽濃度條件下，隨著N的提高，kL呈直線上升趨勢。主要因為在此條件下，隨著N的提高，增加了界膜兩側水相淀粉酶與有機相中含α-淀粉酶膠束的擴散，提高了“空膠團”的更新速率。當分別在高pH和低鹽濃度條件下，隨著N的提高，kL呈拋物線上升趨勢。主要原因除了上述因素外還存在由于靠水相界面一側產(chǎn)生強烈的湍動使液膜厚度降低，從而降低了液膜阻力，即對流作用改變了界面膠團的狀態(tài)使“緊密”界面變成“流動”界面導致傳質(zhì)性質(zhì)發(fā)生了改變，故表現(xiàn)為“雙斜率特性”[15]。

圖3 不同pH條件下，攪拌轉速對傳遞系數(shù)kL的影響Fig.3 Effectof rotate speed on transfer coefficient kL at different pH

圖4 不同NaCl濃度條件下，攪拌轉速對傳遞系數(shù)kL的影響Fig.4 Effectof NaCl concentration on transfer coefficient kL at different rotate speed

2.3.2 水相pH對kL的影響 從圖3可知，隨著pH的升高，kL對N就越敏感，表明pH對界面的組成和阻力有著顯著的影響。當pH9.9時，N對kL乎沒有影響，由此可見在該條件下主要為界面化學控制；當pH在10.8條件下，隨著N的提高kL呈直線上升，表明在此條件下萃取過程呈現(xiàn)以界面控制為主的混合控制；當pH 11.9條件下，隨著N的提高kL呈拋物線上升，表明在此條件下萃取過程呈現(xiàn)以擴散控制為主的混合控制。pH對擴散系數(shù)kL影響的一個主要原因是pH越高于α-淀粉酶等電點p I，其帶負電荷越多，α-淀粉酶與帶正電荷的反膠束靜電作用就越強，所以α-淀粉酶在液膜中分子擴散系數(shù)DL相對就低，而kL與DL呈正相關，故pH相對越小傳遞系數(shù)kL就越小。

2.3.3 不同離子強度條件下N對kL的影響 NaCl在該體系中起到增溶作用，當NaCl濃度低于0.03mol·L-1時，兩相界面出現(xiàn)乳化現(xiàn)象使界面渾濁難以操作。從圖4可知，N=250r·min-1時，隨著離子強度的升高kL反而降低。主要是由于隨著離子強度提高，反膠束內(nèi)表面雙電層變薄，導致α-淀粉酶與反膠束表面的靜電引力減弱和親和力降低。從圖4中還可以看出，當離子濃度大于0.05mol·L-1時，隨著N的提高kL增加的幅度不大，說明此時離子強度對靜電引力作用影響很大，導致反膠團萃取過程處于界面化學控制為主；離子濃度為0.03mol·L-1時，隨著N的提高kL大幅度提高，萃取過程由界面化學控制轉換為擴散控制為主。

2.4 表面活性劑CTAB對kL的影響

通過調(diào)節(jié)CTAB的濃度，檢測、計算不同濃度條件下的kL值并作圖5。由圖5可知，隨著CTAB濃度的增加kL隨之增加。主要由于CTAB量的增大提高了反膠束的濃度，引起相界反膠束面積增大，從而強化了傳質(zhì)速率，界面控制逐步減弱。但當CTAB濃度高于0.03mol·L-1時，隨著濃度增加kL值提高緩慢，當增加到0.05mol·L-1時萃取系統(tǒng)變渾濁。

圖5 表面活性劑CTAB對表觀傳遞系數(shù)的影響Fig.5 Effectof CTAB concentration on transfer coefficient kL

2.5 助表面活性劑對kL的影響

CTAB是單鏈陽離子表面活性劑，其非極性尾部較少，故體系中必須加入助表面活性劑即助溶劑，才能形成穩(wěn)定的反膠束溶液[4]。本文通過加入正丁醇促使CTAB在萃取體系中形成穩(wěn)定的反膠束。通過改變正丁醇與異辛烷的比例，考察其對kL的影響，結果見圖6。從圖6可知，隨著正丁醇比例提高kL升高，但是當比例超過0.25時，隨著正丁醇比例的提高，kL急劇下降。這主要是因為在較低正丁醇濃度時，隨其濃度的升高，界面中反膠束的數(shù)量與穩(wěn)定性增大，α-淀粉酶的萃取率也相應提高；而當正丁醇濃度過高時，導致反膠束體積變小，形成“空間位阻”效應，α-淀粉酶不易進入，因此助溶劑正丁醇與有機相異辛烷應有一個合適的比例。

圖6 助表面活性劑Butanol對表觀傳遞系數(shù)的影響Fig.6 Effectof Butanol ratio on transfer coefficient kL

2.6 比界面積S對kL和萃取速率R的影響

不同pH條件下，考察不同比界面積Sn對萃取速率Rn的影響。Sn代表不同比界面積；Rn代表反應速率；S0代表比界面積為0.062cm-1；R0代表比界面積為0.062mm-1時的萃取速率。以不同pH條件下的相對比界面積為橫坐標，相對萃取速率為縱坐標作圖，見圖7。

由圖7結合2.3.2結果可知，當界面控制對表觀傳遞系數(shù)kL影響越嚴重，相對萃取速率對相對界面積的斜率就越大，故可以通過斜率的大小對萃取過程的限制步驟進行評估。由此可知，當pH為9.9、10.8、 11.9，α-淀粉酶萃取過程分別以界面控制、混合控制、擴算控制為主。

圖7 比界面積對萃取速率的影響Fig.7 Effectofspecific interfacialareaon extraction rate

3 結論

3.1 根據(jù)“雙膜理論”利用恒界面池，建立了反膠團萃取動力學方程。利用該模型探討了α-淀粉酶反膠束萃取過程的影響因素，為利用動力學模型分析反膠團萃取α-淀粉酶優(yōu)化與控制提供了依據(jù)。

3.2 在以CTAB單鏈陽離子為表面活性劑的反膠束萃取中，α-淀粉酶萃取的表觀傳質(zhì)系數(shù)kL受到pH、離子強度、攪拌轉速、表面活性劑、助表面活性劑因素的影響，且能夠改變反膠束萃取α-淀粉酶過程控制類型。

3.3 通過調(diào)節(jié)比界面的大小，根據(jù)萃取速率對比界面積的相對斜率大小可以用來判定α-淀粉酶反膠束萃取過程控制的類型。

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Study on extraction kinetics ofα-am ylase using reversed m icelles

ZHANG Jian-guo，CHEN Xiao-m ing，XIONG Shuang-li，QIAN Hui-fang
（School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Based on two-film theory the kinetic model aboutα-am ylase extraction by CTAB-n-butanolisooctane solution as the reversed m icellar extraction system was estab lished.Varied conditions inc luding initial enzyme activity，stirring speed，pH and ionic strength in aqueous phase，concentration of surfactant and cosolvent were performed on a stirred transfer cell w ith constant interface to determ ine the overall transfer coefficients（kL）.The relationship of control type and interfacial area was also stud ied.The results showed that the slope about the common logarithm of residual enzyme activity to extrac tion time was constant，which suggested that this kinetic model could ag ree w ith extrac tion p rocess and the relationship of kLw ith initial enzyme activity were uncorrelated when its activity was at 1105U·L-1to 4420U·L-1.The p rocess of transfer mechanism was affec ted by the stirring speed，especially by the cond itions such as pH and ionic streng th in aqueous phase，and concentration of surfactant and co-solvent.The relative slope of extraction rate to interfacial area was m inished contrarily w ith the increase of pH.Moreover，the mechanism of extraction types was mainly controlled by resistance of interface，cooperation and d iffusion when pH was 9.9，10.8 and 11.9 respectively which was performed at the appointed cond itions.It also ind icated that the relative slope of extraction rate to interfacialarea could be used to evaluate the deg ree of influence of interface resistance.

α-am ylase；reversed m icellar extraction；kinetic model；overall transfer coefficients（kL）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）22-0105-05

2012－05－21

張建國（1973-），男，碩士研究生，講師，研究方向：發(fā)酵工程。

國家自然科學基金（11075134）。