牛肺臟中肝素提取工藝優(yōu)化

楊懷彬，張 麗，韓 玲，*，曹 暉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070;

2.陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司，陜西寶雞 722300)

牛肺臟中肝素提取工藝優(yōu)化

楊懷彬1，張 麗1，韓 玲1，*，曹 暉2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070;

2.陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司，陜西寶雞 722300)

本研究以牛肺臟為原料，采用鹽解－樹脂吸附及蛋白質(zhì)沉淀除去雜質(zhì)的方法提取和分離肝素。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、鹽濃度、樹脂用量，利用旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝為料液比1∶15(g∶mL)，鹽濃度5%，樹脂量7%，此條件下肝素得率理論值為362.02mg/kg，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)肝素得率為356.65mg/kg。鹽解－樹脂吸附方法可行可靠，重復(fù)性好，提取完全，更適合工廠化生產(chǎn)，且為秦寶雪花牛肺臟中肝素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

肝素，響應(yīng)面，鹽解－樹脂吸附，提取

中國(guó)年產(chǎn)牛肉約700萬t，牛肺臟的量約為75萬t，牛肺臟中含有非常豐富的肝素，這就為大量生產(chǎn)肝素提供材料來源。肝素(Heparin)，是由β－D－葡糖醛酸(或α－L艾杜糖醛酸)和N－乙酰氨基葡糖形成重復(fù)二糖單位組成的黏多糖，其不但有抗凝血、抗血栓形成的作用，還有抗炎、抗過敏等生物學(xué)功能［1－2］。肝素主要是由緊靠血管的肥大細(xì)胞產(chǎn)生，并貯存于肥大細(xì)胞的顆粒中，一定的刺激下釋放［3－4］。肝素最早從肝臟中提取，1916年美國(guó)學(xué)者M(jìn)cleen在研究凝血問題中，成功地從狗的肝臟提取了肝素［5］，1940年正式納入美國(guó)藥典用于臨床醫(yī)學(xué)，至今已有70余年歷史。目前國(guó)內(nèi)外肝素都是從動(dòng)物臟器中提取得到的天然肝素及其化合物，近半個(gè)世紀(jì)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和深入研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物肺臟和心臟中肝素逐漸被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有肝素的提取方法有鹽解－樹脂交換法、酶解－樹脂交換法、超聲波輔助鹽解法和鹽解酶解結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)采用鹽解－樹脂交換法對(duì)牛肺臟肝素提取工藝進(jìn)行研究和探究，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、安全、可靠、經(jīng)濟(jì)節(jié)約，為工廠化生產(chǎn)和對(duì)牛肺臟肝素提取提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

牛肺臟 陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司秦寶雪花牛，屠宰后直接取肺臟裝袋標(biāo)記放入－4℃冷庫中冷凍，在冷凍條件下運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，放在－80℃冷凍室，在7天時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn);肝素標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥物生物檢定所(北京);陶氏AMBERLITETMFPA98CL食品級(jí)特種聚合物(樹脂) 上海唯高實(shí)業(yè)有限公司;氫氧化鈉、硫酸、硼砂、乙醇(95%) 均為分析純。

JJ－2B組織搗碎勻漿機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠; PH－3C計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;756P紫外－可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;洗脫柱Φ30mm×300mm 大連日普利科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝素的提取工藝流程 原料→提取→吸附→洗滌→洗脫→沉淀→脫水干燥→肝素鈉粗品

1.2.2 具體操作要點(diǎn)

1.2.2.1 預(yù)處理 將牛肺樣品從冷凍室內(nèi)取出，在自然條件下解凍。解凍完畢取牛肺樣品100g，按1∶10 (g∶m L)加入蒸餾水，在組織搗碎機(jī)中充分破碎至肉糜狀，轉(zhuǎn)移至1000m L燒杯中備用。

1.2.2.2 提取 采用2mol/L NaOH溶液調(diào)杯內(nèi)肉糜pH至8.5，加入樣品量的5%的NaCl 60℃下每間隔10m in攪拌30s，連續(xù)進(jìn)行此操作2h，2h后立即升溫至100℃，靜置10m in沉淀蛋白，以100目篩過濾，收集濾液［6－8］。

1.2.2.3 吸附 濾液冷卻至50℃，用2mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，加入8%樹脂(樹脂用蒸餾水沖洗至中性)，于恒溫磁力攪拌器中50℃下，連續(xù)吸附8h，以100目篩過濾，收集樹脂備用。

1.2.2.4 洗滌和洗脫 將樹脂裝入洗脫柱，以蒸餾水反復(fù)沖洗至無色，用1.2mol/L的NaCl浸泡洗滌樹脂30m in，棄濾液。在樹脂洗脫柱中加入5mol/L的NaCl浸泡3h，用燒杯收集浸提液;再用3.5mol/L的NaCl浸泡2h(連續(xù)兩次)，用同一個(gè)燒杯收集液體，濾液燒杯中備用。

1.2.2.5 沉淀蛋白 將濾液用1∶1(V∶V)的HCl調(diào)pH至3.5，靜置30m in，沉淀酸蛋白，用濾紙過濾;將上次濾液用2mol/L NaOH調(diào)pH10，靜置3h，沉淀堿蛋白，用濾紙過濾，濾液備用。

1.2.2.6 乙醇沉淀 取濾液用1.5倍體積95%乙醇加入燒杯中，搖勻靜置12h，真空抽濾，保留固體，濾液收集進(jìn)行乙醇回收。

1.2.2.7 粗品干燥 把抽濾得到的固體在真空干燥箱中60℃下真空干燥，用天平稱量至兩次的稱量重量相差在0.02g即達(dá)到恒重，得到肝素粗品。

1.2.3 肝素提取工藝優(yōu)化設(shè)計(jì) 選取料液比(g∶m L)、鹽濃度、樹脂用量3個(gè)因素進(jìn)行肝素得率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采用旋轉(zhuǎn)正交組合優(yōu)化設(shè)計(jì)。

1.2.3.1 肝素提取單因素實(shí)驗(yàn) 料液比對(duì)肝素得率影響實(shí)驗(yàn):設(shè)定蒸餾水和樣品的料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g/m L七個(gè)水平，鹽濃度為5%，樹脂用量為8%，吸附時(shí)間為8h條件下實(shí)驗(yàn);鹽濃度對(duì)肝素得率影響實(shí)驗(yàn):設(shè)定鹽濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%七個(gè)水平，料液比為1∶15g/m L，樹脂用量為8%，吸附時(shí)間為8h條件下實(shí)驗(yàn);樹脂用量對(duì)肝素得率影響實(shí)驗(yàn):設(shè)定樹脂用量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%七個(gè)水平，料液比為1∶15g/m L，鹽濃度為5%，吸附時(shí)間為8h條件下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、鹽濃度、樹脂量為變化因子，以肝素濃度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面旋轉(zhuǎn)組合方式進(jìn)行對(duì)牛肺臟肝素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)20組，每組做三個(gè)平行，利用Design－Expert8.05b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以獲得最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素分別以X1、X2和X3代表，肝素的得率用Y代表，因素水平及編碼值見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Test factor levels and coding

1.2.4 肝素濃度測(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用肝素標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確稱取肝素標(biāo)準(zhǔn)品，配成482μg/m L肝素水溶液，再按0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1m L的梯度，分別吸取不同體積的肝素水溶液，用蒸餾水定容到1m L，向每份溶液中分別加入3m L含0.025mol/L硼砂的90%(V∶V)的硫酸溶液，充分搖勻，置于90℃水浴中，攪動(dòng)，10m in后取出，冷至室溫，30m in后采用紫外－可見分光光度計(jì)測(cè)定298nm下樣品光密度(另做不加肝素，以水代之的空白實(shí)驗(yàn)作對(duì)照)，重復(fù)3次，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 肝素濃度的測(cè)定 采用濃硫酸氧化法來檢測(cè)溶液中肝素的濃度［9］。將肝素粗品用四分法取出定容至25m L容量瓶中，吸取1m L待測(cè)液加入玻璃管中，加入3m L含0.025mol/L硼砂的90%(V∶V)硫酸溶液，搖勻，90℃下水浴，攪動(dòng)，10min后取出，冷至室溫，30m in后采用紫外－可見分光光度計(jì)測(cè)定其298nm下光密度(另做不加肝素，以水代之的空白實(shí)驗(yàn)作對(duì)照)，重復(fù)3次，取平均值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可得到提取物中肝素含量。

肝素得率計(jì)算公式:

式中:A為樣品所測(cè)得的吸光度值;M總為所得肝素粗品的總重量，g;m溶為溶解在25m L容量瓶中肝素的重量，g;m樣為所取牛肺樣品的重量，g;25為定溶于25m L容量瓶中;n為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得最佳提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用肝素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)做出肝素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

以肝素濃度為橫坐標(biāo)X，肝素在298nm的吸光度為縱坐標(biāo)Y，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為:Y=0.0039X+0.052，R2=0.9996。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對(duì)肝素得率的影響 不同料液比條件下提取肝素的得率見圖2。由圖2可知，當(dāng)液料比在5～15m L/g范圍內(nèi)時(shí)，隨著液料比的增加，肝素得率增加，肝素得率呈上升趨勢(shì);當(dāng)液料比在15～35m L/g范圍內(nèi)時(shí)，肝素得率沒有明顯的增加，差異不顯著。因原料中肝素的含量有限，隨著料液比增大到一定值時(shí)，肝素已經(jīng)全部溶于溶液中，故料液比達(dá)到15m L/g時(shí)，肝素得率不再升高。

表3 旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)回歸方程各項(xiàng)方差分析表Table 3 Rotary combination design regression equation the anova table

圖1 肝素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of heparin concentration

圖2 料液比對(duì)肝素得率的影響Fig.2 Effect ofmaterial liquid ratio on heparin yield

2.2.2 鹽濃度對(duì)肝素得率的影響 圖3為不同鹽濃度條件下提取肝素的得率。由圖3可知，鹽濃度達(dá)到5%時(shí)肝素的得率最大，因?yàn)辂}濃度的大小與肝素活性和溶解度有關(guān)，鹽濃度過低肝素溶解不完全，提取率低;鹽濃度過高肝素會(huì)重新析出，故肝素得率隨著鹽濃度的增大而增大，但達(dá)到一定值時(shí)會(huì)隨著鹽濃度的增大而減小。

2.2.3 樹脂用量對(duì)肝素得率的影響 圖4是不同樹脂用量對(duì)肝素得率的影響結(jié)果。從圖4中可以得到隨著樹脂用量的增加肝素的得率不斷增加，當(dāng)樹脂用量達(dá)到7%左右時(shí)肝素得率基本保持不變。溶液中肝素的含量一定，當(dāng)樹脂用量較小時(shí)，肝素不能全部被吸附，隨著樹脂用量增加肝素得率增加，當(dāng)樹脂達(dá)到能將所有肝素吸附時(shí)，隨著樹脂用量的增加肝素得率基本不變。

圖3 鹽濃度對(duì)肝素得率的影響Fig.3 Effect of salt concentration on heparin yield

圖4 樹脂用量對(duì)肝素得率的影響Fig.4 Effect of resin content on heparin yield

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化肝素提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果 采用Design－Expert 8.05b對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素回歸擬合。回歸分析結(jié)果及各項(xiàng)方差分析見表3。根據(jù)回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，該模型回歸顯著，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以作為鹽解法提取肝素的理論值。各因素回歸擬合后，得到的回歸擬合方程為:

從表3中可以得到模型項(xiàng)p≤0.01，說明Y與X1、X2、X3的回歸方程是極顯著的;失擬項(xiàng)對(duì)應(yīng)的p=0.0591≥0.05，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，表示Y與X1、X2、X3的回歸方程的關(guān)系較好。

表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)YTable 2 Central composite design scheme and sites experimental data Y

由圖5～圖7可以看出兩兩因子之間均有交互作用，為了進(jìn)一步確定最優(yōu)化組合，采用Design－Expert 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到肝素提取率最大時(shí)的條件，經(jīng)過分析得出:在X1=0.08g/m L，X2=4.89%，X3= 7.10%時(shí)，肝素最大得率為366.965mg/kg，根據(jù)實(shí)際情況確定最佳提取條件為料液比為1∶15，鹽濃度為5%，樹脂量為7%，此時(shí)的理論最大值為362.022mg/kg。

圖5 料液比和鹽濃度對(duì)肝素提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Material liquid ratio and salt concentration on the yield of heparin influence the response surface

圖6 料液比和樹脂量對(duì)肝素提取率影響的響應(yīng)面Fig.6 Material liquid ratio and resin content extraction on the influence of heparin yield response surface

圖7 鹽濃度和樹脂量對(duì)肝素提取率影響的響應(yīng)面Fig.7 Salt concentration and resin content on the influence of heparin extraction yield response surface

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照以上最佳提取條件組合料液比為1∶15，鹽濃度為5%，樹脂量為7%進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到肝素平均得率為356.65mg/kg，驗(yàn)證值與模型理論值相差1.48%。結(jié)果與肝素提取率預(yù)測(cè)值較接近，故確定此工藝條件為秦寶雪花牛肺臟肝素提取的最佳工藝條件。

3 結(jié)論

3.1 采用鹽解－樹脂吸附對(duì)牛肺臟肝素的提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)和旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝優(yōu)化，結(jié)論如下:擬合了料液比、鹽濃度、樹脂用量這3個(gè)因素對(duì)肝素提取率的回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好地預(yù)測(cè)牛肺臟中肝素提取率。通過回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為:料液比＞樹脂用量＞鹽濃度。由該模型確定的最優(yōu)工藝為料液比為1∶15，鹽濃度為5%，樹脂量為7%。在此條件下，牛肺中肝素提取率為356.65mg/kg。

3.2 目前國(guó)內(nèi)外常采用的提取肝素的方法有很多。劉忠霞［10］等在肝素的制備與質(zhì)量控制中采用鹽解－樹脂交換法在豬小腸粘膜中提取的肝素率為133.33mg/kg。江燕［11］等在肝素鈉粗品工業(yè)化高效生產(chǎn)工藝的探討中肝素率為308.00mg/kg。本研究采用鹽解－樹脂吸附法在最佳提取工藝條件下肝素的提取率高達(dá)356.65mg/kg，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，與其他文獻(xiàn)相比有明顯的增加。對(duì)已經(jīng)采用最佳工藝提取的肉樣同樣采取最佳提取條件進(jìn)行再一次提取，多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明第二次的肝素平均得率為0.87mg/kg，從而得到第一次的提取已經(jīng)將肝素提取完全，不需要再進(jìn)一步提取。實(shí)驗(yàn)采用鹽解－樹脂吸附法對(duì)秦寶雪花牛和秦川牛肺臟肝素提取，此方法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，重現(xiàn)性好，更適合于工廠化生產(chǎn)。

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Optim ization of heparin extraction process from bovine lung

YANG Huai－bin1，ZHANG Li1，HAN Ling1，*，CAO Hui2
(1.College of Food Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 2.Shaanxi Qinbao Animal Husbandry Development Co.，Ltd.，Baoji722300，China)

The bovine lungs as the research material，extrac ted and separated heparin w ith the salt solution－resin adsorp tion and p rotein to remove impurities p recip itation method.Three extraction parameters inc luding material liquid ratio，salt concentration and resin content were op tim ized using rotating orthogonal combination design p rincip le and the response surface m ethod for p rocess op tim ization.The results ind icated that the best extrac tion p rocess were m aterial liquid ratio for 1∶15(g∶m L)，salt concentration at 5%and resin content of 7%.Accord ing to these cond itions，the yield of heparin was 362.02m g/kg，and under the verificative test cond ition the p rac tical values was 356.65mg/kg.Salt solution－resin adsorp tion method was feasib le and reliab le，repeatability，extrac tion com p letely，more suitab le for industrial p roduction and p rovid ing the theory for the development and utilization of lungs heparin of QinBao cattle.

heparin;response surface;salt solution－resin adsorp tion;extract

TS255.1

B

1002－0306(2012)19－0214－05

2012－04－16 *通訊聯(lián)系人

楊懷彬(1989－)，男，碩士研究生，研究方向:畜產(chǎn)品加工。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助(CARS－38)。