高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定原料乳中的舒巴坦

劉珊珊，單 藝，滿朝新，謝鯤昊，盧 雁，胡惠秩，閻天文，姜毓君，，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150086)

高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定原料乳中的舒巴坦

劉珊珊1，單 藝2，滿朝新2，謝鯤昊1，盧 雁2，胡惠秩1，閻天文1，姜毓君1，2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150086)

建立了利用高效液相色譜-二極管陣列法（high-performance liquid chromatography-photodiode array，HPLC-PDA)測定原料乳中舒巴坦含量的方法。采用C18色譜柱，以5.44g/L磷酸二氫鉀溶液（pH5.0)-乙腈（95∶5)為流動相，流速為lmL/min，檢測波長220nm，柱溫30℃。樣品經(jīng)乙腈提取、乙酸鋅沉淀蛋白，HPLC-PDA檢測。舒巴坦?jié)舛仍?0～200μg/mL范圍內(nèi)，線性良好（R2=0.9998)，添加回收率為98.82%～101.42%，檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg。該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于原料乳中舒巴坦的快速檢測。

舒巴坦，高效液相色譜-二極管陣列檢測法，含量測定，原料乳

舒巴坦（sulbactam，簡稱SBT)，又稱青霉烷砜酸，屬于青霉烷砜類半合成β-內(nèi)酸胺酶抑制劑，是一種競爭性、不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物[1]。臨床數(shù)據(jù)表明，過量使用舒巴坦可引起患者轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶升高，并可能引起皮疹，藥熱等過敏反應(yīng)。研究報道顯示，現(xiàn)有檢測舒巴坦的方法包括分光光度方法[2]、毛細管電泳方法[3]、氣-質(zhì)聯(lián)用方法[4]、液-質(zhì)聯(lián)用法[5]、高效液相方法[6-10]。分光光度方法的檢測限較低;毛細管電泳方法檢測基質(zhì)范圍有限;氣-質(zhì)聯(lián)用方法中，樣品前處理需要進行衍生化反應(yīng)，操作復(fù)雜，回收率低;液-質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，抗干擾能力強，但是設(shè)備昂貴。高效液相法操作簡便、成本低廉，便于推廣。自2009年春季起，一些違法份子在含有β-內(nèi)酰胺酶的原料乳中添加舒巴坦，使該酶失去活性，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶陽性奶不能被檢測出來，為乳品安全埋下隱患，嚴(yán)重威脅消費者的身體健康，降低了人民群眾對食品安全尤其是乳品安全的信任度，因此建立原料乳中舒巴坦的檢測方法已經(jīng)迫在眉睫，然而，國家尚未出臺舒巴坦的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。本研究工作建立了一種高效簡便的檢測原料乳中舒巴坦的高效液相色譜-二極管陣列檢測方法，適用于檢測機構(gòu)、科研院所、工廠等單位進行乳中舒巴坦的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度＞99%;乙腈 色譜純，Sigma公司;原料乳 黑龍江省哈爾濱市周邊奶站;磷酸、磷酸二氫鉀等其他試劑 國產(chǎn)分析純。

2695高效液相色譜儀、2998二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站 美國Waters;BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;MILLIPORE超純水儀 美國密理博;色譜柱：Hypersil ODS C-18（250mm×4.6mm，5μm) Thenno Hypersil公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 采用Hypersil ODS2 C-18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm);以5.44g/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（95∶5)為流動相，緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配制，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。流速1mL/min;檢測波長為220nm;柱溫30℃;進樣體積10μL。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 緩沖溶液 乙酸鋅溶液（200g/L)：稱取20g乙酸鋅于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸溶液（1mol/L)：稱取6.28mL磷酸溶液于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸鹽緩沖液（5.44g/L)：稱取5.4g磷酸二氫鉀，加入800mL水溶解，磷酸調(diào)pH至5.0，加水定容至1000mL。

1.2.2.2 儲備液 精密稱取100mg舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，以磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液按實驗需要用流動相稀釋相應(yīng)濃度。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取原料乳10g于三角瓶中，加入35mL乙腈，混勻，超聲提取30min。冷卻至室溫，加入200g/L乙酸鋅2.0mL，乙腈定容至50mL，渦旋0.5min，10000r/min離心5min，收集上清液10mL，10000r/min再離心5min，將上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，即可進行HPLC-PDA測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理過程的確定

本實驗采用有機沉淀體系（乙腈、甲醇)與無機沉淀體系相結(jié)合的方法沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。由于原料乳中的蛋白質(zhì)含量較高，單純使用乙腈作為沉淀劑，無法沉淀完全，殘留的蛋白質(zhì)會堵塞色譜柱，影響實驗的進行，因此采用乙腈初沉后，加入乙酸鋅再次沉淀原料乳中蛋白質(zhì)的兩段式沉淀法。當(dāng)采用甲醇作沉淀試劑時，在稀釋10倍下沉淀蛋白效果良好，但峰形較差，出現(xiàn)肩峰;最終采用乙腈作沉淀試劑，在稀釋5倍下沉淀蛋白效果良好，回收率理想，同時改善了峰形。

2.2 色譜條件的確定

參照美國藥典26版和日本藥典14版，檢測舒巴坦的波長分別為230、220nm。本實驗將舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～400nm波長范圍內(nèi)進行掃描，見圖1。根據(jù)二極管陣列檢測器獲得的光譜圖可知，舒巴坦在194nm處有最大吸收，以此最大吸收波長為檢測波長，等濃度下對舒巴坦進行HPLC測定，發(fā)現(xiàn)此時舒巴坦的峰值最高，峰面積穩(wěn)定。采用194nm檢測波長，相同條件下對乳品中舒巴坦進行測定，發(fā)現(xiàn)雖然舒巴坦被定性保留，但由于乳基質(zhì)成分較多且復(fù)雜，前處理過程不可能把諸如短鈦物質(zhì)都沉淀完全，因此會有其他物質(zhì)的干擾，使舒巴坦峰的基線分離不完全，峰面積不準(zhǔn)確。基于以上原因，本實驗最后選定末端吸收220nm作為檢測波長。

圖1 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品全波長掃描曲線Fig.1 The full scan curve of sulbactam standard solution

舒巴坦是極性物質(zhì)，易溶于水中，在甲醇中略溶[11]。因此本實驗選用Hypersil ODS C-18（250mm× 4.6mm，5μm)色譜柱，舒巴坦得到較好的保留。參考2005版中國藥典[12]，確定流動相為5.44g/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈。舒巴坦易被強酸、強堿物質(zhì)降解[13]，本實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)緩沖鹽溶液pH＜3.0時，溶質(zhì)分子通常會降解成其他物質(zhì)，導(dǎo)致峰裂解;當(dāng)緩沖鹽溶液pH＞6.0時，舒巴坦幾乎全被降解成6-氨基青霉烷酸，導(dǎo)致主成分損失;當(dāng)緩沖鹽溶液pH4.0～5.0時，色譜峰窄而尖，舒巴坦性質(zhì)穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)降解現(xiàn)象，因此，最終選擇pH5.0作為流動相的酸堿度，舒巴坦保留良好，且達到基線分離。

從圖2中可以看出，舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為5.027min，原料乳樣品中舒巴坦的保留時間為5.054min，與標(biāo)準(zhǔn)品中舒巴坦的保留時間基本一致。

圖2 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖與原料乳中舒巴坦色譜圖Fig.2 Chromatograms of sulbactam standard solution and sulbactam in milk spiked

2.3 工作曲線

在上述色譜條件下，配制舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液10、50、100、150、200μg/mL每個濃度樣品平行3次實驗。以峰面積（Y)為縱坐標(biāo)，濃度（X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程y=10196x+70083，相關(guān)系數(shù)（R2)為0.9998，說明在10～200μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖3。該方法定量限為0.75mg/kg（按信噪比S/N＞10計算)，檢出限為0.25mg/kg（按信噪比S/N＞3計算)。

圖3 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of sulbactam

2.4 精密度與回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取空白原料乳，分別加入舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液5、50、100μg/mL，進行3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗，各濃度做3次平行，進行HPLC-PAD測定，該方法的回收率在98.82%～101.42%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.31%～2.76%之間，見表1。

表1 原料乳中添加舒巴坦的回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of sulbactam in raw milk

3 結(jié)論

本研究采用反相C18色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液（pH5.0)-乙腈作為流動相，樣品經(jīng)乙腈溶液提取，乙酸鋅沉淀蛋白，得到舒巴坦在原料乳中的保留時間為5.054min。該方法快速可靠，經(jīng)大量實驗結(jié)果驗證，適合原料乳中舒巴坦的檢測要求，填補了國內(nèi)空白。建立了HPLC-PDA方法檢測乳中舒巴坦含量。采用二極管陣列檢測器對樣品峰進行全波長掃描，避免其他物質(zhì)的干擾，定性更可靠。樣品前處理操作簡便、無需凈化，不但大大縮短了樣品前處理時間，同時也減少樣品在處理過程中的損失，使得分析物質(zhì)的回收率大大提高。因此采用HPLC-PDA法檢測原料乳中舒巴坦的含量具有更普遍的應(yīng)用性。

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Determination of sulbactam in raw milk by the high-performance liquid chromatography-photodiode array detection

LIU Shan-shan1，SHAN Yi2，MAN Chao-xin2，XIE Kun-hao1，LU Yan2，HU Hui-zhi1，YAN Tian-wen1，JIANG Yu-jun1，2，*
（1.Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Department of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

To develop a method for the determination of sulbactam in raw milk using high performance liquid chromatography-photodiode array detector（HPLC-PDA).C18column was used，the mobile phase consisted of 5.44g/L potassium dihydrogen phosphate solution（pH5.0)-acetonitrile（95∶5)at the flow rate of 1mL/min，the detection wavelength was 220nm.The column temperature was 30℃.Acetonitrile was used for extraction，zinc acetate was used for protein precipitation，the filtered fluid was determined by high performance liquid chromatography-photodiode array detector.The linear calibration curve was obtained in the concentration range of 1～200μg/mL（R2=0.9998)with the lower limit of detection of 0.25mg/kg and lower limit quantification of 0.75mg/kg.The average recovery of sulbactam was 98.82%～101.42%.The method was simple，accurate，reliable and could be used for rapid determination of sulbactam in raw milk.

sulbactam;high-performance liquid chromatography-photodiode array（HPLC-PDA)detection;content measured;raw milk

TS252.7

A

1002-0306（2012)16-0064-03

2012－01－06 *通訊聯(lián)系人

劉珊珊（1982-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

國家科技支撐計劃課題（2012BAK17B04);國家科技支撐計劃課題（2009BADB9B06)。