子宮腺肌病PGP 9.5、NGF的表達(dá)及其與痛經(jīng)的關(guān)系

王文莉 段 華 張 穎 郭銀樹 成九梅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100026)

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是最常見的引起繼發(fā)性痛經(jīng)的疾病之一，雖然繼發(fā)性痛經(jīng)發(fā)生率很高，但目前對其發(fā)病機(jī)制的了解仍然有限。本研究旨在探討蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在ADS中的表達(dá)情況，研究神經(jīng)因子在ADS中的表達(dá)及其與痛經(jīng)的關(guān)系，探討上述因子在ADS發(fā)病及痛經(jīng)產(chǎn)生中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2008年8月～2008年12月間在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心接受手術(shù)治療的未絕經(jīng)ADS患者30例，患者年齡28～51歲，平均年齡(45.90±3.97)歲，術(shù)前根據(jù)視覺模擬評分法［1］(visual analogue scale/score，VAS)對ADS患者的痛經(jīng)程度進(jìn)行評分，輕度痛經(jīng)者12例、中度痛經(jīng)者9例、重度痛經(jīng)者9例。在30例患者中取60例病理標(biāo)本，分為2組:①ADS在位子宮內(nèi)膜組(ADS－E組)30例標(biāo)本，其中增生期子宮內(nèi)膜23例，分泌期子宮內(nèi)膜7例;②ADS子宮肌層組(ADS－M組)30例標(biāo)本。對照組為同期因子宮肌瘤、宮頸病變接受手術(shù)治療的30例患者，取57例標(biāo)本，分為2組:①對照在位子宮內(nèi)膜組(對照－E組)30例標(biāo)本，增生期子宮內(nèi)膜23例，分泌期子宮內(nèi)膜7例?；颊吣挲g26～50歲，平均年齡(41.27±7.05)歲。②對照肌層組(對照－M組)27例標(biāo)本?；颊吣挲g29～50歲，平均年齡(43.44±5.46)歲。全部病例標(biāo)本取材經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意，病理結(jié)果均由2名病理學(xué)專家檢查證實，患者未合并有糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺功能亢進(jìn)等神經(jīng)、內(nèi)分泌疾病，且術(shù)前3個月內(nèi)未接受激素治療。研究組與對照組患者的年齡，剖宮產(chǎn)史、子宮內(nèi)膜增生期與分泌期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1)主要試劑:鼠抗人蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)單克隆抗體(1:100)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、兔抗人神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)單克隆抗體(1:100)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。

2)方法:標(biāo)本經(jīng)10%甲醛浸泡，制成石蠟塊。以人小腸和腦組織切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，每例組織石蠟塊切片3張，1張HE染色核實病理診斷，余2張行免疫組化染色。切片厚4μm，石蠟切片常規(guī)脫蠟浸水，蒸餾水浸泡5min;PBS沖洗3次;枸櫞酸緩沖液煮沸(沸水浴)修復(fù)15 min;PBS沖洗3次;3%過氧化氫水溶液，室溫孕育20 min;PBS沖洗3次;滴加正常山羊血清工作液，37℃孵育15 min，后去除多余正常山羊血清工作液;滴加一抗鼠抗人PGP 9.5單克隆抗體(1:100)、兔抗人NGF單克隆抗體(1:100)4℃過夜。復(fù)溫20 min，PBS沖洗3次;二抗孵育，37℃20min，室溫孵育20 min;PBS沖洗3次;三抗(辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液)孵育，37℃20min;PBS沖洗3次;DAB顯色;自來水充分沖洗，脫水透明、封片。

3)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):采用Lecia光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)，每張切片在Lecia高倍鏡下采用抽簽法隨機(jī)觀察4個視野，電腦計算每個視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值［2］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊者采用獨立樣本 t檢驗，方差不齊者進(jìn)行秩和檢驗，采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在位子宮內(nèi)膜功能層中PGP 9.5、NGF的表達(dá)

ADS－E組可見 PGP 9.5、NGF的表達(dá)，陽性細(xì)胞棕黃色顆粒位于細(xì)胞質(zhì)中 (圖1)。對照－E組未見PGP 9.5的表達(dá)，僅見NGF的表達(dá)(圖2)。對照－E組NGF的表達(dá)明顯低于ADS－E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表1。

表1 在位子宮內(nèi)膜中PGP 9.5、NGF表達(dá)Tab.1 Expression of PGP 9.5 and NGF in endometrium

2.2 子宮肌層中PGP 9.5、NGF的表達(dá)

ADS－M組可見 PGP 9.5、NGF的表達(dá)，陽性細(xì)胞棕黃色顆粒位于細(xì)胞質(zhì)中 (圖3);對照－M組中可見PGP 9.5和NGF的表達(dá)(圖4)。對照－M組PGP 9.5、NGF的表達(dá)明顯低于ADS－M組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表2。

表2 子宮肌層中PGP 9.5、NGF的表達(dá)Tab.2 Expression of PGP 9.5，NGF in myometrium

2.3 PGP 9.5、NGF的表達(dá)與痛經(jīng)的相關(guān)性

在ADS－E組中，隨著痛經(jīng)程度的加重，PGP 9.5、NGF在在位子宮內(nèi)膜功能層中的表達(dá)有顯著的增高趨勢，且PGP 9.5、NGF的表達(dá)與痛經(jīng)程度有顯著相關(guān)性(r=0.520和0.688，P ＜0.05)。

在ADS－M組中，隨著痛經(jīng)程度的加重，PGP 9.5和NGF的表達(dá)有顯著的增高趨勢，且與痛經(jīng)程度有顯著相關(guān)性(r=0.543和0.503，P＜0.01)。

3 討論

3.1 子宮腺肌病中神經(jīng)纖維的分布特點

蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5，PGP 9.5)是一種古老而保守的蛋白質(zhì)，屬于泛素水解酶系統(tǒng)，廣泛表達(dá)于神經(jīng)元分化的各個階段，是一個神經(jīng)外胚層細(xì)胞來源的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的特定的組織標(biāo)志物。本研究組采用PGP 9.5標(biāo)記神經(jīng)纖維，發(fā)現(xiàn)ADS在位子宮內(nèi)膜功能層可見PGP 9.5染色的神經(jīng)纖維，而在對照組正常子宮內(nèi)膜功能層卻未見神經(jīng)纖維分布，在子宮內(nèi)膜基底層可見有PGP 9.5標(biāo)記的神經(jīng)纖維存在，在腺肌病灶中也可見有神經(jīng)纖維存在，且神經(jīng)纖維多位于腺體和脈管周圍，與其伴行;Tokushige N 等［3－4］研究發(fā)現(xiàn)傳導(dǎo)慢痛的 C 類神經(jīng)纖維在子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)在位子宮內(nèi)膜見表達(dá)，而非EMS患者未見表達(dá)。在小鼠的子宮內(nèi)膜異位癥模型的異位病灶也可見有P物質(zhì)(substance P，SP)、降鈣基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、囊泡單胺類轉(zhuǎn)運體染色的纖維存在，異位灶中密集的神經(jīng)纖維分布臨近血管周圍，神經(jīng)突觸沿著血管分布于子宮肌層及上皮層［5］。不僅如此，PGP 9.5本身作為泛素水解酶系統(tǒng)的重要成員，還參與細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的代謝，在細(xì)胞永生中起重要作用，與各種神經(jīng)相關(guān)性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病等)，惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、預(yù)后相關(guān)，是獨立的風(fēng)險因子，在神經(jīng)再生，腫瘤細(xì)胞侵入的調(diào)節(jié)方面有重要作用［6－7］。因此，ADS患者在位子宮內(nèi)膜中增生的神經(jīng)纖維和高度表達(dá)的神經(jīng)生長因子可能為在位的子宮內(nèi)膜提供了生長及侵襲所需的營養(yǎng)，促進(jìn)在位子宮內(nèi)膜發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲，在異位內(nèi)膜持續(xù)生長、浸潤周圍器官起到了重要作用，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，另外ADS中神經(jīng)纖維的特異性表達(dá)為其診斷提供了新的方向，比如宮腔鏡下內(nèi)膜活檢甚至刮宮獲取子宮內(nèi)膜功能層行病理檢查，有助于早期診斷ADS，為后續(xù)的治療提供了更大的空間。

3.2 子宮腺肌病中神經(jīng)纖維及因子與痛經(jīng)的關(guān)系

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，產(chǎn)生于傳入纖維的外周靶組織和支持細(xì)胞，如角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和Schwann細(xì)胞。它可促進(jìn)中樞及外周神經(jīng)元的正常發(fā)育與分化，并對受損神經(jīng)元有促再生和保護(hù)作用。NGF可以引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞觸枝(neurite)的延伸，維持感覺神經(jīng)元的生存、發(fā)育，并選擇性的營養(yǎng)參與疼痛調(diào)節(jié)的小感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元;同時NGF也是疼痛外周敏感化產(chǎn)生的重要介質(zhì)之一，它能誘導(dǎo)中樞疼痛的調(diào)節(jié)因子P物質(zhì)(SP)，降鈣基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽的生成。缺乏NGF和其特殊受體TrKA的轉(zhuǎn)基因動物出生后表現(xiàn)為缺乏介導(dǎo)傷害性疼痛的神經(jīng)元和痛覺減退，而NGF過表達(dá)的動物則表現(xiàn)為痛覺過敏［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，PGP 9.5、NGF在ADS患者子宮內(nèi)膜的表達(dá)與痛經(jīng)程度成正相關(guān)，即PGP 9.5、NGF的表達(dá)越高，痛經(jīng)程度越重。Barcena de Arellano M L等［8］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者痛經(jīng)與腹水中神經(jīng)因子表達(dá)成正相關(guān)，子宮內(nèi)膜異位癥病灶可釋放一些刺激神經(jīng)纖維的分子，如腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、PGI2、PGE2、PGF2α以及 NGF使異位病灶局部器官的神經(jīng)纖維向異位病灶內(nèi)生長［9］;同時，子宮內(nèi)膜異位癥病灶也可以產(chǎn)生分泌許多疼痛介質(zhì)，比如PGs、組胺、緩激肽、NGF和白介素等，這些疼痛介質(zhì)可以刺激末梢神經(jīng)纖維，產(chǎn)生疼痛［10］，并且神經(jīng)纖維密度和子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)痛經(jīng)呈正相關(guān)［11］，Zhang G等［12］報道子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型中卵巢囊腫周圍血管和神經(jīng)隨著小鼠的動情周期變化，在病灶周圍形成血管及神經(jīng)，并且在動情前期可以誘發(fā)痛覺過敏。腺肌病灶內(nèi)的神經(jīng)纖維有可能是由于在位子宮內(nèi)膜中本身含有神經(jīng)纖維，移位至其他部位繼續(xù)生長而來;也可能由于異位病灶分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如TNF－a、PGI2、PGE2 和 NGF 等［13］，病灶周圍正常組織的神經(jīng)纖維受各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激，長入異位病灶所致，并且其促進(jìn)異位病灶的生長。據(jù)此推測，神經(jīng)因子的增高可導(dǎo)致局部感覺神經(jīng)纖維敏感性增高產(chǎn)生痛覺，且由于內(nèi)臟神經(jīng)沖動的傳入特點，可能發(fā)生痛覺過敏的現(xiàn)象［14－15］，病灶局部神經(jīng)纖維痛覺的傳入就可以表現(xiàn)為痛經(jīng)。

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