人宮頸癌側(cè)群細胞的分選及其生物學特性的研究

宋菁華 王克芳 李 斌 張 軍

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100029)

宮頸癌是發(fā)生于全球婦女中僅次于乳腺癌的最常見的惡性腫瘤，全世界每年大約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，每年近30萬死亡病例，中晚期患者5年生存率很低［1］。目前宮頸癌病因尚未完全明了，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，宮頸癌發(fā)病的分子機制始終是研究的熱點和難點。近年來，隨著腫瘤干細胞學說［2］的提出，以及越來越多的腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC;或tumour stem cells，TSC)相繼在腫瘤組織中分離成功，為腫瘤研究提供了新的途徑。側(cè)群細胞(side population cells)即SP細胞是指一小群可以將脂溶性DNA結(jié)合染料(即Hoechst 33342)排出細胞外的細胞，在流式分選的散點圖中，這些細胞處于大多數(shù)細胞的一側(cè)。研究［3］顯示，SP細胞具有干細胞特性。盡管目前各學科對腫瘤干細胞的研究進行得如火如荼，但在宮頸癌中，無論是針對宮頸癌干細胞的研究還是針對宮頸癌側(cè)群細胞的研究，都處在起步階段。本課題立足于腫瘤干細胞學說，擬通過宮頸癌細胞中側(cè)群細胞的富集、分離和鑒定，確定其腫瘤干細胞特性，探討以側(cè)群細胞作為宮頸癌干細胞研究切入點的可行性，為進一步研究宮頸癌干細胞的靶向治療策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)標本來源:選取2009年12月至2010年12月于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科施行宮頸癌手術(shù)的病例標本40例(均經(jīng)患者或委托人知情同意)，其中鱗癌32例、腺癌6例、惡性腺瘤1例、腺鱗癌1例。40例標本中高分化癌5例、中分化癌23例、低分化癌12例。腫瘤均為原發(fā)性，術(shù)前均未進行放療和化療，所有標本均經(jīng)北京安貞醫(yī)院病理科2名以上有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師確診為宮頸癌并按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2009年宮頸癌的臨床分期標準進行分期。所有標本均在手術(shù)切除后30min內(nèi)取材并送實驗室。

2)實驗動物:雌性非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠，4～6周齡，購買并飼養(yǎng)在北京大學醫(yī)學院實驗動物科學部［實驗動物合格證號:SCXK(京)2006－0008］。

3)實驗試劑:DMEM/F12 1:1培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液購自Solarbio公司，碘化丙咤(Pl)、維拉帕米(verapamil hydrochloride)、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(MTT)和膠原酶I購自Sigma-Aldrich公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自貝博生物公司。

1.2 實驗方法

1)宮頸癌細胞原代培養(yǎng)及細胞傳代:術(shù)中在新鮮腫瘤組織邊緣無壞死、鈣化及電凝部位無菌取材，置于培養(yǎng)基中(DMEM/F12，內(nèi)含10%FBS)。修剪去除壞死組織及殘余血管，用PBS沖洗3遍，將組織塊剪碎，經(jīng)0.14%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶-EDTA 37℃分別消化30min，100μm濾網(wǎng)過濾去渣，4℃下1 000 r/min離心10min，棄上清，收集含細胞的沉淀，移至培養(yǎng)瓶中，以含有10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，洗掉未貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。從取材到接種在2h內(nèi)完成。原代培養(yǎng)3～5d時行第1次換液，以后每3～4 d半量換液1次，每7d按1∶2傳代。

2)流式分選:選取處于對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL。向?qū)嶒灲M及對照組細胞懸液中加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/mL，對照組在加入 Hoechst 33342前加拮抗劑維拉帕米至終濃度50μg/mL，避光，于 37℃孵育90min，每隔 15min混勻 1次。4℃1 000 r/min離心10 min，去上清，預冷的PBS洗滌細胞1遍。以含2%FBS的PBS重懸，經(jīng)40μm濾網(wǎng)過濾后于4℃下存放至檢測。碘化丙啶(PI)染色標記死亡細胞，過流式細胞儀前5min加入PI至終濃度1μg/mL，。將制備好的細胞懸液入流式細胞儀，檢測SP細胞的比例。參數(shù)如下:激發(fā)波:HOE:UV(351-364)HOE blue:450 HOE red:675 Pl:488nm。為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來的可能誤差，SP細胞的比例取實驗組與對照組之間的差值。在相同波長條件下，對已通過檢測的細胞懸液進行分選，得到宮頸癌側(cè)群(SP)細胞和非側(cè)群(NSP)細胞亞群。

3)宮頸癌SP和NSP細胞生物學功能鑒定

①細胞生長曲線:將新鮮分離的SP和NSP細胞分別接種于96孔板，1 000個細胞/孔，分別接種32孔，每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后，SP和NSP細胞各取4孔，分別加入50mg/mL的MTT 20 μL，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱4h;取出培養(yǎng)板，吸凈培養(yǎng)液及MTT，每孔加入 DMSO 150 μL，搖床震蕩 10min，酶標儀讀OD490值;每24 h測1次OD490值，每次SP和NSP各4孔，連續(xù)測8 d，4孔OD490的平均值即為當天細胞的OD值;實驗共重復3次。取3次實驗的平均數(shù)繪制生長曲線。

②裸鼠移植瘤試驗:選取4～6周齡NOD/SCID雌性裸鼠32只，采用抽簽法隨機分為8組，每組4只。按照三級動物要求，飼養(yǎng)在25℃恒溫無特定病原體(specific pathogen free，SPF)屏障系統(tǒng)內(nèi)，12 h光照和12 h黑暗交替，自由進食標準顆粒飼料及飲水。將新鮮分離的SP和NSP細胞離心，PBS重懸，計數(shù)，以PBS調(diào)整細胞密度為 1×103、1×104、1 ×105、1×106/mL，將不同密度SP和NSP細胞各0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，每種細胞每個數(shù)量級接種4只裸鼠，觀察8周。

③化療藥物敏感性分析:化療藥物選擇順鉑。將新鮮分離的SP和NSP細胞接種至96孔板，1 000個細胞/孔，加入200 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);吸凈培養(yǎng)基，分別加入不同終濃度的順鉑(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，每個濃度設(shè)3個復孔，其中0濃度為無藥對照，另設(shè)3孔只加培養(yǎng)液不加細胞作為調(diào)零孔。每孔培養(yǎng)基調(diào)整為200μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入已配置好的MTT 20 μL，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h;棄去上清，每孔加入DMSO 150 μL，于振蕩器上振蕩10 min，使其徹底溶解混勻;酶標儀讀OD490值，以只加培養(yǎng)液不加細胞的孔作為調(diào)零孔進行調(diào)零，取3個復孔的均值為實驗結(jié)果。計算細胞增生抑制率:細胞增生抑制率=1－實驗組OD值/無藥對照組OD值;實驗重復3次，取3次抑制率的平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5軟件完成，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差±s)表示，統(tǒng)計學處理分別采用t檢驗、χ2檢驗、方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人宮頸癌細胞形態(tài)

光學顯微鏡下，宮頸癌細胞形態(tài)符合病理學描述(圖1)，符合本研究需要。

圖1 人宮頸癌細胞Fig.1 Human cervical cancer cells(100×)

2.2 宮頸癌SP細胞流式檢測結(jié)果

人宮頸癌細胞染色后去除PI陽性的死細胞，分析狀態(tài)良好的活細胞Hoechst 33342熒光染色情況。流式細胞儀可檢測到宮頸癌細胞中SP細胞的存在比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，加入維拉帕米的對照管SP細胞比例下降至0%或接近0%的水平(圖2)。不同分化程度的宮頸癌細胞分別檢測，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，即在檢測的高、中、低分化的宮頸癌細胞中，SP細胞比例與分化程度有關(guān)，分化程度越差者其SP細胞比例越低，詳見表1。

表1 不同分化程度宮頸癌細胞SP比例Tab.1 Proportion of the SP cells with different degree of cervical cancer cells

2.3 細胞生長曲線

MTT法繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示:SP細胞與NSP細胞相比生長速度較快，從第3天開始，SP細胞開始大量增生，尤其是第5天起，SP細胞明顯進入指數(shù)增長期，而NSP細胞增生緩慢(圖3)。SP細胞和NSP細胞的增生能力差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 裸鼠成瘤效果

實驗結(jié)果顯示，SP細胞和NSP細胞的致瘤能力差異有統(tǒng)計學意義(表2)，僅1×103個SP細胞即可形成腫瘤，平均成瘤時間(13.27±2.61)d。而至少1×105個NSP細胞才能形成腫瘤，平均成瘤時間(18.50±1.52)d。相同數(shù)量的SP細胞在同一觀察時間點可以形成更大的腫瘤，且形成腫瘤的潛伏期較短。

圖2 人宮頸癌SP細胞流式檢測圖Fig.2 Expressions of cell related markers in human cervical cancer cells as detected by flow cytometry A:Hoechst 33342;B:Hoechst 33342 and verapamil;SP:side population.

圖3 宮頸癌SP和NSP細胞生長曲線Fig.3 Cell growth curve of SP cells and NSP cells

2.5 化療藥物敏感性分析

將SP細胞和NSP細胞分別在不同濃度的化療藥物中作用24h后，應(yīng)用MTT法檢測細胞存活狀況。結(jié)果顯示:化療藥物作用后，SP和NSP細胞均出現(xiàn)一定程度的細胞死亡，但SP細胞表現(xiàn)出較強的耐藥性，只出現(xiàn)少量細胞死亡，而NSP細胞存活明顯減少，細胞增生抑制率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 宮頸癌SP和NSP細胞裸鼠的成瘤性情況Tab.2 Tumorigenicity of SP cells and NSP cells in nude mice

表3 宮頸癌SP和NSP細胞增生抑制率情況Tab.3 Inhibition rates of SP cells and NSP cells n=9，%

3 討論

腫瘤干細胞是存在于腫瘤中的一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群，具有自我更新能力，能夠分化成不同表型的腫瘤細胞，使腫瘤在體內(nèi)不斷擴大或形成新的腫瘤。除此之外的其他絕大多數(shù)腫瘤細胞沒有或僅有有限的增生能力，經(jīng)短暫的分化增生后即發(fā)生凋亡。腫瘤干細胞的分離和鑒定最初來源于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，而實體腫瘤細胞較難以分離。目前腫瘤干細胞的分離和培養(yǎng)主要有2種方法，即通過細胞表面特異性標記進行分選和側(cè)群(SP)細胞分選法。組織特異性干細胞的嚴格分離鑒定只在少數(shù)組織中完成，許多實體組織自身的干細胞表面標志物尚未確定，故限制了此方法的應(yīng)用。SP細胞作為一個特殊的細胞亞群，其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎干細胞和成體干細胞之間，具有很強的多向分化潛能和增生特性，且有較明確的表型標記和分離純化方法，以SP細胞作為切入點來進行宮頸癌干細胞篩選，可望為進一步深入研究宮頸癌干細胞建立基礎(chǔ)。

本研究選用宮頸癌原代培養(yǎng)細胞進行流式分選，為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來的可能誤差，SP細胞的比例取實驗組與對照組之間的差值。結(jié)果顯示，宮頸癌細胞中存在一定數(shù)量的SP細胞，比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，并可被維拉帕米阻斷，阻斷后 SP細胞比例減少至0～0.60%(0.28%±0.20%)。SP細胞的比例隨分化程度的降低而下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。迄今，有關(guān)腫瘤分化程度與SP細胞比例的關(guān)系報道較少，且意見不一。Brown M D等［4］研究前列腺腫瘤時發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度越高，其SP細胞比例越高。而Wu C等［5］發(fā)現(xiàn)分化不良的間葉源性腫瘤中的SP細胞比例高于分化良好的腫瘤細胞。目前對這一現(xiàn)象仍缺乏公認的解釋，推測出現(xiàn)上述差異的原因可能有:①分化較差的宮頸癌細胞中SP細胞的增生能力和自我更新能力可能更強，故只需較低比例的SP細胞即可維持腫瘤的惡性生物學行為;②分化較差的宮頸癌細胞中NSP細胞的增生能力可能更強，在SP細胞絕對數(shù)相似的情況下，NSP細胞的絕對數(shù)較大，從而導致其SP細胞的相對比例下降。

作為一個特殊的細胞亞群，SP細胞具備自我更新能力和高致瘤性。Xu J X等［6］研究發(fā)現(xiàn)SP細胞的擴增倍數(shù)可以達到1 000～5 000倍，而NSP細胞的擴增有時甚至不能達到2倍。為了探討分選出的SP細胞是否具有腫瘤干細胞特性，我們進行了一系列的實驗。采用MTT法檢測SP細胞和NSP細胞的增生能力，發(fā)現(xiàn)SP細胞的增生能力顯著強于NSP細胞，2組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗結(jié)果表明，與宮頸癌NSP細胞相比，宮頸癌SP細胞具有更強的增生能力。在腦膠質(zhì)瘤［7］、神經(jīng)母細胞瘤［8］、鼻咽癌［9］、乳腺癌［10］、肝癌［11］等多種腫瘤的研究中均有類似發(fā)現(xiàn)。但也有學者對這一現(xiàn)象提出質(zhì)疑，認為NSP細胞在分選后增生較差，可能與分選采用的Hoechst 33342對NSP細胞的毒性作用有關(guān)［12］，然而，Hoechst 33342 染料的半衰期較短，且在分裂過程中難以大量傳入子代細胞中而影響其增生［13］，單純以Hoechst 33342染料的毒性作用來解釋上述現(xiàn)象難以令人信服。為了探求宮頸癌SP細胞的致瘤能力，我們采用NOD/SCID小鼠行皮下接種成瘤實驗，把不同數(shù)量級的SP和NSP細胞移植到NOD/SCID小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)SP細胞的成瘤能力明顯強于NSP細胞。

大量臨床和基礎(chǔ)研究［2，7-8］顯示，各種腫瘤對化療藥物的敏感性不一，許多腫瘤經(jīng)過手術(shù)和藥物治療，腫瘤已經(jīng)幾乎消失，但是，很快又復發(fā)了。根據(jù)干細胞學說［14］，干細胞一般對化療藥物耐藥，能夠排除化療藥物的毒性，從而成功逃避化療藥物的作用，從而存活下來。雖然大部分腫瘤細胞被殺死了，但是只要腫瘤干細胞還存在，腫瘤就會很容易復發(fā)。因此探討腫瘤細胞的耐藥性，尋找腫瘤復發(fā)的原因，為腫瘤化療提供新的靶點，具有重要的臨床意義。由于在部分組織中SP細胞表型產(chǎn)生的主要因素是ABCG2/BCRP1的表達，而ABCG2/BCRP1又是主要的耐藥蛋白［15］，故我們推測，SP細胞可能和宮頸癌的化療耐藥相關(guān)。我們用MTT法檢測化療藥物順鉑對SP和NSP細胞生長的作用，發(fā)現(xiàn)順鉑對NSP細胞的生長抑制明顯，對SP細胞的生長抑制不明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這個結(jié)果支持SP細胞可能和宮頸癌化療耐藥相關(guān)的假設(shè)。

本研究應(yīng)用流式細胞儀分選宮頸癌SP細胞，經(jīng)各種體內(nèi)、外鑒定實驗證實，宮頸癌SP細胞具有腫瘤干細胞的生物學特性，生長速度快，自我更新和分化能力強，且具有強大的致瘤性和耐藥性，可作為宮頸癌干細胞研究的切入點，為宮頸癌干細胞的靶向治療深入研究提供了實驗基礎(chǔ)。

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