紫甘薯花色苷制備及其抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)活性的研究

雷用東，陳姍姍，趙曉燕，張 莉，馬 越，童軍茂，*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003;

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097)

紫甘薯花色苷制備及其抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)活性的研究

雷用東1，陳姍姍2，趙曉燕2，張 莉2，馬 越2，童軍茂1，*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003;

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097)

為研究紫甘薯花色苷對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的抑制作用，實(shí)驗(yàn)純化了紫甘薯花色苷提取物，并采用液質(zhì)聯(lián)機(jī)的方法鑒定其結(jié)構(gòu)組成;將制備的花色苷提取物作用于侵染TGEV的豬睪丸(ST)細(xì)胞，研究對(duì)TGEV誘導(dǎo)ST細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和凋亡情況的影響，揭示花色苷對(duì)TGEV的預(yù)防和治療效果。結(jié)果表明:紫甘薯花色苷提取物中主要含8種花色苷?；ㄉ召|(zhì)量濃度低于60μg/mL時(shí)，ST細(xì)胞生長良好且無細(xì)胞毒性;接種TGEV后，20μg/mL的花色苷就能抑制TGEV的增殖，且在安全濃度范圍內(nèi)抑制程度成劑量關(guān)系。在此體外實(shí)驗(yàn)中，花色苷對(duì)TGEV的預(yù)防效果比治療效果更明顯。結(jié)論:紫甘薯花色苷在20～60μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)TGEV有很好的抗病毒功效。

紫甘薯，花色苷，豬睪丸細(xì)胞，豬傳染性胃腸炎病毒，MTT法

花色苷屬于生物類黃酮，是一種多酚類化合物［1］，具有多重生物活性功能，如清除體內(nèi)自由基;降低氧化酶活性;抗氧化、抗突變、抗腫瘤和抗過敏;抑制金黃色葡萄球菌生長的作用;減輕肝功能障礙和預(yù)防心血管疾病等功效［2－8］，廣泛應(yīng)用于飲料、果汁、糖果、果醬、保健品飲料等食品工業(yè)及醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域，然而關(guān)于對(duì)病毒作用的研究未有報(bào)道。紫甘薯花色苷是從紫甘薯的塊根中浸提出的一類天然的花色苷色素(Anthocynins from Purple Sweet Potato，APSP)，色澤鮮亮、安全、無毒、無異味。豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)能夠?qū)е仑i傳染性胃腸炎，使出生仔豬大批死亡，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［9－10］，本研究以紫甘薯花色苷為研究對(duì)象，以ST細(xì)胞為宿主細(xì)胞，研究花色苷對(duì)TGEV誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及凋亡率的影響，揭示其抗TGEV功能，開辟了花色苷抗病毒研究的新領(lǐng)域，為豬傳染性胃腸炎預(yù)防與治療提供新思路，具有重要的理論及實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫甘薯 購自北京市農(nóng)林科學(xué)院彰化農(nóng)貿(mào)市場;豬睪丸(ST)細(xì)胞系 由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧所高室提供;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) Thermo公司;胰蛋白酶 美國BD公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京冬歌生物科技有限公司，分析純;二甲基亞砜(DMSO)、3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Sigma公司;其余試劑 為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計(jì)UV－3802型 上海尤尼柯公司;液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC 1200 series，MS IonTrap 6310) 安捷倫公司;超凈工作臺(tái)SW－CJ－2FD 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;CO2水套式培養(yǎng)箱4520型 美國NAPC0公司;倒置顯微鏡TE300日本Nikon公司;酶標(biāo)儀550 美國Bio－Rad公司;細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)分析儀CYT－100 日本CYTORECON公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫甘薯花色苷樣品的制備 提取溶劑為60% (V/V)的乙醇水溶液，并用1mol/L的鹽酸將提取溶劑的pH調(diào)為3.0;料液比為1∶8;提取溫度50℃;提取時(shí)間2h;提取次數(shù)1次。

將粗提液過AB－8大孔樹脂純化。上樣后，采用3倍柱體積的蒸餾水除去蛋白、多糖等雜質(zhì)，用60%的乙醇溶液洗脫，得到純化后的花色苷提取液，旋蒸濃縮后得到純化的紫甘薯花色苷濃縮液，真空干燥得到紫色粉末。采用0.01mol/L PBS將紫甘薯花色苷配制成1mg/mL的質(zhì)量濃度，0.22μm濾膜過濾備用。

1.2.2 紫甘薯花色苷的主要成分分析 液質(zhì)聯(lián)機(jī)的條件如下，HPLC設(shè)定的參數(shù):柱溫:25℃;流速: 0.3mL/min;進(jìn)樣量:3μL;流動(dòng)相A:0.5%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:0.5%甲酸乙腈;洗脫梯度:0min 10% B;30min 60%B;32min 10%B;DAD檢測器:花色苷的定量計(jì)算使用檢測波長520nm。

MS設(shè)定的參數(shù):干燥氣溫度為350℃;N2流速為11L/min;電壓3500V;噴霧器壓力為30psig;離子掃描范圍為100～2200(m/z)。整個(gè)過程均采用正離子模式，數(shù)據(jù)使用 Agilent Chemstation Rev.A.09.01 software(Agilent，Palo Alto，CA)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 ST細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng) 從－196℃液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速投入37℃的水浴中適當(dāng)搖晃，使冰凍的細(xì)胞迅速融解(40～60s內(nèi))，用毛細(xì)吸管吸出細(xì)胞懸液，置入預(yù)先按每毫升細(xì)胞懸液內(nèi)加入5倍量預(yù)熱至37℃的含20%FBS的MEM營養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃的5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4～12h。在細(xì)胞貼壁后，即可換入新含10%FBS的MEM營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至長成單層后換液或傳代。按1∶2傳代，0.25%胰蛋白酶消化后，加入10%FBS的MEM營養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 紫甘薯花色苷對(duì)ST細(xì)胞生長的影響 用生長液調(diào)節(jié)ST細(xì)胞濃度為1～5×105cells/mL，每個(gè)孔200μL將ST細(xì)胞液滴于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿成單層80%左右，棄培養(yǎng)液。隨后用無血清培養(yǎng)液洗一次，再用含2%FBS的MEM維持液調(diào)節(jié)紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度為 20、30、40、50、60、70、80μg/mL，總體積為200μL/well，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h和72h采用MTT法測定，棄液，每孔加入15μL MTT溶液(MTT質(zhì)量濃度為5g/L)，37℃孵育4h后小心棄液，每孔加170μL DMSO，振蕩搖勻10min。最后在490nm單波長下測定各孔吸光值，通過OD值的大小間接反映細(xì)胞存活情況［11］。設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度分別做6個(gè)平行孔，以減少誤差。同時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 紫甘薯花色苷體外抗TGEV活性的研究 預(yù)防效果實(shí)驗(yàn):按照上述APSP對(duì)ST生長實(shí)驗(yàn)方法鋪96孔板，待細(xì)胞鋪滿80%，接入不同質(zhì)量濃度紫甘薯花色苷，37℃孵育1～2h，隨后按體積的10%再接入稀釋后的TGEV，孵育1～2h后，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48h和72h時(shí)，測定OD490。治療效果實(shí)驗(yàn):待細(xì)胞鋪滿80%左右時(shí)，先接入病毒孵育1～2h，再接入不同質(zhì)量濃度紫甘薯花色苷和維持液，最后測定其OD490。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用Origin8軟件作圖和DPS統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉX±S表示，多組間采用單因素ANOVA分析，多重比較采用q檢驗(yàn)，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義即有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯花色苷提取物的HPLC-MS成分分析

紫甘薯花色苷的HPLC見圖1。多峰狀態(tài)顯示紫甘署含多種組份，八個(gè)主峰為其主要的成分組成。結(jié)合質(zhì)譜信息，根據(jù)其保留時(shí)間、UV圖譜、母離子及子離子碎片信息，并參考其它文獻(xiàn)［12－15］，鑒定了八種主要成分的結(jié)構(gòu)。

圖1 紫甘薯主要花色苷的HPLC－MS色譜圖(520nm)Fig.1 HPLC－MS profiles(520nm) of the major anthocyanins from purple sweet potato

紫甘薯塊根中的花色苷主要成分見表1，與前人研究結(jié)果相同，主要是不同?；Y(jié)合的芍藥糖苷及矢車菊糖苷［15－18］。

2.2 紫甘薯花色苷對(duì)ST單層細(xì)胞生長的安全濃度研究

安全濃度是指對(duì)單層細(xì)胞無影響的最小藥物稀釋度，本文通過不同質(zhì)量濃度的紫甘薯花色苷作用于ST單層細(xì)胞，檢測其生長情況，明確花色苷的安全濃度，結(jié)果見表2。

從表2可知，紫甘薯花色苷與ST細(xì)胞作用48h和72h后，質(zhì)量濃度在20～40μg/mL時(shí)，均顯著地促進(jìn)了ST細(xì)胞的生長，培養(yǎng)72h較48h的促進(jìn)效果更強(qiáng)，尤其濃度在20μg/mL時(shí)，較對(duì)照組(OD值=0.558)提高了21%。但是，當(dāng)質(zhì)量濃度高于70μg/mL時(shí)，OD值逐漸降低，對(duì)細(xì)胞生長有影響，由此明確花色苷對(duì)ST細(xì)胞的最大安全濃度為60μg/mL。

延長培養(yǎng)時(shí)間，第5d時(shí)對(duì)照細(xì)胞開始慢慢脫落單層而死亡，低濃度的花色苷處理組仍能保持單層細(xì)胞，可見紫甘薯花色苷直接影響了ST細(xì)胞生長和存活時(shí)間。紫甘薯花色苷是優(yōu)良的天然抗氧化劑，史海英等［19］研究發(fā)現(xiàn)花色苷對(duì)細(xì)胞有抗輻射損傷作用，同時(shí)資名揚(yáng)等［20］研究證實(shí):紫甘薯花色苷有抗氧化性，并對(duì)細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，因此一定濃度范圍內(nèi)可能提高了ST細(xì)胞機(jī)能，從而促進(jìn)其生長。

表1 紫甘薯中主要的花色苷組分Table 1 The major anthocyanin components of purple sweet potatoes

表2 紫甘薯花色苷對(duì)ST細(xì)胞生長的影響(±S，n=6)Table 2 Effect of APSP on the influence of ST cell growth(±S，n=6)

表2 紫甘薯花色苷對(duì)ST細(xì)胞生長的影響(±S，n=6)Table 2 Effect of APSP on the influence of ST cell growth(±S，n=6)

注:ST對(duì)照為未處理組;每一列(或每一行)中數(shù)據(jù)上標(biāo)字母完全不同表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(p＜0.05)。

項(xiàng)目 ST對(duì)照 紫甘薯花色苷濃度(μg/mL) 20 30 40 50 60 70 80 48h 0.536±0.020b0.633±0.032a0.65±0.020a0.697±0.014a0.585±0.036b0.547±0.045b0.408±0.094c0.377±0.032c 72h 0.558±0.030c0.676±0.038a0.623±0.040b0.607±0.012b0.568±0.034c0.512±0.029d0.392±0.029e0.244±0.028f

2.3 紫甘薯花色苷體外抑制TGEV活性的研究

紫甘薯花色苷對(duì)ST細(xì)胞單層生長的最大安全濃度為60μg/mL，因此實(shí)驗(yàn)在安全濃度范圍內(nèi)研究其抗TGEV的活性。

從圖2可知，ST細(xì)胞接入TGEV培養(yǎng)48h后，ST細(xì)胞存活率僅為18.91%，當(dāng)加入20μg/mL的紫甘薯花色苷進(jìn)行預(yù)防實(shí)驗(yàn)處理時(shí)，ST存活率為39.84%，隨著濃度增加抑制效果增強(qiáng)，尤其在60μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率比未加花色苷的 TGEV對(duì)照提高了60.61%。結(jié)果顯示對(duì)TGEV具有明顯的預(yù)防作用。

圖2 不同濃度紫甘薯花色苷體外抑制TGEV的作用(48h)Fig.2 Influence of prevention and treatmenton TGEV under different concentration of APSP

治療方面，與預(yù)防趨勢大體一致。其中，20μg/mL濃度下ST細(xì)胞的存活率為20.29%，隨著濃度增加抑制效果增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度50μg/mL時(shí)的存活率比未加花色苷的TGEV對(duì)照組高出41.82%。結(jié)果顯示紫甘薯花色苷對(duì)TGEV具有治療作用，治療效果與濃度成劑量關(guān)系。然而與預(yù)防作用比較，治療效果明顯偏低。

從圖3可知，以ST細(xì)胞為參照，培養(yǎng)72h，病毒對(duì)照組的ST細(xì)胞存活率趨近于零，此時(shí)ST細(xì)胞全部發(fā)生病變、脫落死亡。加入20μg/mL花色苷的預(yù)防實(shí)驗(yàn)處理組的ST存活率為3.44%，增加到60μg/mL時(shí)，存活率為13.94%，與48h比較，ST細(xì)胞的存活率較低，大部分細(xì)胞脫落死亡。治療方面，抗病毒趨勢與預(yù)防作用一致，然而治療效果明顯低于預(yù)防處理。此外，無論是治療還是預(yù)防實(shí)驗(yàn)，抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力均明顯低于48h的效果，可見，此體外實(shí)驗(yàn)中，花色苷抑制TGEV活性時(shí)需及早處理，并且預(yù)防效果更好。

圖3 不同濃度紫甘薯花色苷體外抑制TGEV的作用(72h)Fig.3 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APSP

2.4 紫甘薯花色苷與TGEV對(duì)ST細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡圖顯示:正常的ST細(xì)胞貼壁后(圖4A)，在顯微鏡下多為多角形或短梭形，當(dāng)鋪滿瓶底時(shí)，呈鋪路石狀，大小均勻。60μg/mL紫甘薯花色苷處理72h后(圖4B)，ST單層表面完整，細(xì)胞大小均一，細(xì)胞飽滿，形成完整單層，無空隙，細(xì)胞折光性良好，無破碎死亡，不影響細(xì)胞的生長。細(xì)胞進(jìn)行病毒侵染48h(圖4C)，發(fā)生嚴(yán)重的病變，無正常細(xì)胞形態(tài)，極少貼壁，細(xì)胞全部脫離單層。質(zhì)量濃度60μg/mL紫甘薯花色苷作用于接入TGEV的ST細(xì)胞培養(yǎng)48h(圖4D)，結(jié)果顯示部分細(xì)胞脫離單層，細(xì)胞數(shù)也明顯較稀疏，細(xì)胞收縮或者膨脹、變圓，細(xì)胞間隙增加，與未加花色苷的病毒對(duì)照組比較，能保護(hù)ST的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制TGEV增殖和延長ST細(xì)胞的壽命。

圖4 紫甘薯花色苷對(duì)ST細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)Fig.4 Effect of APSP on ST morphology under microscope(×200)

3 結(jié)論

本文分離鑒定了紫甘薯花色苷主要為含有八種不同?；Y(jié)合的芍藥糖苷和矢車菊糖苷。制備的紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度低于60μg/mL時(shí)，對(duì)ST細(xì)胞生長無毒性。質(zhì)量濃度20～60μg/mL能夠顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，降低凋亡率，抑制程度成劑量關(guān)系。在此體外實(shí)驗(yàn)中，花色苷對(duì)TGEV的預(yù)防效果比治療效果明顯。本文初步研究表明紫甘薯花色苷對(duì)豬胃腸炎病毒具有抑制作用，但其抑制機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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Preparation and anti－TGEV activity of anthocyanin from purple sweet potato

LEI Yong－dong1，CHEN Shan－shan2，ZHAO Xiao－yan2，ZHANG Li2，MA Yue2，TONG Jun－mao1，*
(1.College of Food，Shihezi University，Shihezi 832003，China;
2.Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097，China)

To study the inhibitory action of anthocyanins from purple sweet potato(APSP)to TGEV in vitro，the sample of anthocyanins extract was purified and its structure was identified by HPLC－MS.The prepared anthocyanins extract was acting on disseminated TGEV in swine testicle cell，then research its influence on the morphological changes as well as apoptosis of ST cell and reveal its prevention and treatment on TGEV.The result showed that the extract of purple sweet potato contains eight major anthocyanins.When mass concentration of APSP was less than 60μg/mL，ST cell grow well without the cell toxicity.Introduced TGEV to ST，20μg/mL APSP could restrain the proliferation of TGEV after 48h and 72h cultivation，and inhibition effect was dose－response in the security concentration range.At the same time，it was obvious that there was better prevention effect than treatment effect in this study.In summary，APSP had very good antiviral efficacy for TGEV in 20～60μg/mL.

purple sweet potato;anthocyanin;ST cell;TGEV;MTT

TS201.4

A

1002－0306(2012)21－0349－04

2012－04－01 *通訊聯(lián)系人

雷用東(1988－)，男，碩士研究生，研究方向:果蔬貯藏與加工。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972048)。