葡萄汁調(diào)控?cái)嗄檀笫笮∧c抗氧化能力與形態(tài)發(fā)育的影響

阮 征，劉世強(qiáng)，黃小流，周 艷，歐陽(yáng)崇學(xué)，印遇龍，3，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047;

2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌 330031;

3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125)

葡萄汁調(diào)控?cái)嗄檀笫笮∧c抗氧化能力與形態(tài)發(fā)育的影響

阮 征1，2，劉世強(qiáng)1，2，黃小流1，2，周 艷1，2，歐陽(yáng)崇學(xué)1，2，印遇龍1，2，3，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047;

2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌 330031;

3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125)

目的:研究葡萄汁對(duì)斷奶大鼠小腸發(fā)育的影響。方法:選取16只斷奶SD大鼠，分為2個(gè)組:對(duì)照組，葡萄汁組。記錄第0、7、14、21、28、35d大鼠的體重及每周總采食量。35d后處死取樣，準(zhǔn)確稱量大鼠脾臟重量，記錄小腸長(zhǎng)度，測(cè)定回腸中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性，應(yīng)用組織學(xué)方法對(duì)回腸的形態(tài)學(xué)指標(biāo)及淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:與對(duì)照組相比，35d時(shí)葡萄能顯著增加斷奶大鼠的體重(p＜0.05)、體重生長(zhǎng)率(p＜0.05)、小腸長(zhǎng)度(p＜0.05)、回腸中的SOD活力(p＜0.05);顯著降低回腸中MDA的含量(p＜0.05)。結(jié)論:葡萄汁能促進(jìn)斷奶大鼠小腸發(fā)育。

葡萄汁，斷奶大鼠，小腸，抗氧化，形態(tài)

腸道是哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)成分消化吸收的主要場(chǎng)所，其功能正常與否對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收以及營(yíng)養(yǎng)物代謝具有重要影響。哺乳動(dòng)物提前或早期斷奶后出現(xiàn)消化不良、腹瀉等癥狀，稱為斷奶應(yīng)激綜合征［1－2］。研究表明，主要原因是斷奶應(yīng)激對(duì)哺乳動(dòng)物腸道組織的損傷很大(包括形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能)［3－4］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)斷奶動(dòng)物的免疫力低下，(腸道)免疫系統(tǒng)功能發(fā)育與成熟緩慢［5］。因此，采取營(yíng)養(yǎng)物調(diào)控來(lái)減小斷奶應(yīng)激對(duì)腸道的不利影響，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。葡萄作為一種常見的水果，含有大量的生理活性物質(zhì)，其中一些具有良好的抗氧化，抗腫瘤，抗衰老，提高機(jī)體免疫等作用，如白藜蘆醇、黃酮、類黃酮、原花青素等［6－7］。然而目前對(duì)葡萄中多酚、類黃酮、花色苷素等活性物質(zhì)的研究多集中在單體成分對(duì)疾病的緩解作用［8－9］，對(duì)葡萄整體的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)或生物活性研究較少。我們推測(cè)葡萄汁能通過(guò)提高腸道的抗氧化能力，來(lái)促進(jìn)(或提高)斷奶期腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究以斷奶SD大鼠為模型，通過(guò)灌喂葡萄汁，檢測(cè)斷奶大鼠體重的變化，小腸長(zhǎng)度及其形態(tài)學(xué)，以及腸道組織的抗氧化酶，探討葡萄對(duì)斷奶大鼠小腸發(fā)育的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

普通飼料 南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;巨峰紫葡萄 南昌天虹商場(chǎng);SOD、MDA試劑盒 南京建成生物試劑公司。

0.5%鹽酸乙醇分色液 2.5mL的鹽酸，500mL 75%的乙醇;伊紅乙醇染色液 醇溶伊紅Y 1g溶于100mL 95%乙醇;Ehrlich蘇木精染色液 將2g蘇木精溶于100mL無(wú)水乙醇中配置成2%蘇木精乙醇溶液，15g硫酸鋁鉀溶于100mL蒸餾水中，配成15%硫酸鋁鉀溶液，然后將該兩種溶液混合，再加入10mL冰乙酸，最后加入0.2g碘化鈉，配好的溶液密封，暗處保存。

SC－3614型離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;722E型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理和主要成分及含量的測(cè)定［10－11］購(gòu)買回來(lái)的新鮮葡萄，先用蒸餾水沖洗干凈，去籽后，榨汁，取其汁液即刻給大鼠進(jìn)行灌胃。每日攝入的葡萄汁中含糖 12g/100mL，總多酚610mg/100mL(以沒食子酸當(dāng)量來(lái)表示)，總黃酮17.3mg/100mL(以兒茶素當(dāng)量來(lái)表示)。

1.2.2 動(dòng)物及分組 兩周齡斷奶SD大鼠，購(gòu)自上海西普樂－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。本實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)處理組，每組8只。葡萄汁組大鼠按每千克大鼠質(zhì)量灌喂4g新鮮葡萄汁，對(duì)照組用相同劑量的蒸餾水灌喂，每日上午一次，同時(shí)給予普通飼料，自由飲水，連續(xù)35d。

1.2.3 樣本采集及處理 至第35d，用斷頭法處死大鼠，剖腹，游離小腸，測(cè)量長(zhǎng)度，剪取回腸中間兩段，約2～3cm，一份置于10%中性甲醛固定液中，一份儲(chǔ)藏于－80℃冰箱;取出脾臟，稱重。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.4.1 大鼠體重增長(zhǎng)率的測(cè)定 記錄第0、7、14、21、28、35d各大鼠的體重，按以下方法計(jì)算:

體重增長(zhǎng)率(%)=(X－Y)/Y×100

X為第0、7、14、21、28、35d各大鼠的體重(g);Y為第0d體重(g)。

1.2.4.2 MDA含量以及SOD活性的測(cè)定 將保存于－80℃的回腸組織于4℃解凍、洗凈、碾磨，用生理鹽水配制成10%的回腸組織液。按照試劑盒上的說(shuō)明書測(cè)定回腸組織中MDA含量和SOD的活性。

1.2.4.3 免疫器官及小腸長(zhǎng)度指數(shù)測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)至第35d，對(duì)各大鼠準(zhǔn)確稱重后，斷頭法處死，解剖剝離并取出脾臟和小腸，用濾紙輕輕蘸去表面的血液后進(jìn)行準(zhǔn)確稱重，小腸直接測(cè)量其自然長(zhǎng)度。記錄各實(shí)驗(yàn)大鼠的脾臟重量、小腸長(zhǎng)度。免疫器官指數(shù)及小腸長(zhǎng)度指數(shù)的計(jì)算公式如下［12－13］:

脾臟指數(shù)(g/kg)=脾臟重量(g)/大鼠活重(kg)

小腸長(zhǎng)度指數(shù)(cm/g)=小腸長(zhǎng)度(cm)/大鼠活重(g)

1.2.4.4 常規(guī)石蠟切片的制作及小腸黏膜形態(tài)指標(biāo)和淋巴細(xì)胞數(shù)的測(cè)定［14］動(dòng)物宰殺后，立即取出回腸部分，用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，取末端回腸2cm置于10%中性甲醛固定液中固定24h。然后取出組織塊，組織塊經(jīng)過(guò)梯度乙醇(50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇，每級(jí)停留時(shí)間2～4h)進(jìn)行脫水處理，然后將脫水的組織分別放入二甲苯∶無(wú)水乙醇(1∶1，v/v)和二甲苯中(每停留時(shí)間約1h)透明處理。經(jīng)過(guò)透明處理的組織塊，依次經(jīng)過(guò)浸蠟、包埋、修快、切片和粘片步驟。而后用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫蠟(大約20min)、復(fù)水(依次為無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、蒸餾水，每級(jí)停留時(shí)間大約2min)、Ehrlich蘇木精溶液染色約10min，用蒸餾水洗去多余染料后，加入0.5%鹽酸乙醇溶液分色10s，蒸餾水洗滌，最后加入伊紅乙醇染色液染色1min。染好色的切片再放入95%乙醇和無(wú)水乙醇中各脫水約3min，用二甲苯∶無(wú)水乙醇(1∶1，v/v)透明處理1h，中性樹膠封片，觀察。用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像采集處理系統(tǒng)采圖，測(cè)量回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度，采用麥克奧迪顯微圖像分析軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察測(cè)量。在40倍目鏡下觀察切片，每個(gè)切片選取5個(gè)全視野，記錄每個(gè)視野下的淋巴細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)顯著性水平為p＜0.05，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄汁對(duì)斷奶大鼠體重增長(zhǎng)率的影響

體重是衡量哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，在一定程度上反映了腸道發(fā)育情況。

由圖1可知，從第21d開始葡萄汁組的大鼠體重增長(zhǎng)率開始高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異;直到第35d時(shí)，葡萄汁組斷奶大鼠的體重增長(zhǎng)率有顯著性提高(p＜0.05)，說(shuō)明葡萄對(duì)大鼠生長(zhǎng)率的影響具有一定時(shí)間依賴性，這與James［15］等的研究結(jié)果長(zhǎng)期飲用葡萄汁能顯著提高體重增長(zhǎng)率一致。

圖1 葡萄汁對(duì)斷奶大鼠體重增長(zhǎng)率的影響Fig.1 Effect of grapes juice on growth rate of weight of weaned－rats

2.2 葡萄汁對(duì)斷奶大鼠脾臟、小腸長(zhǎng)度指數(shù)變化的影響

小腸是動(dòng)物消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，其長(zhǎng)度在一定程度上反映了腸道的發(fā)育狀況［16］。脾臟是體內(nèi)最大的淋巴器官，脾臟的發(fā)育不良會(huì)對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫造成巨大的傷害，進(jìn)而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育［17］。

表1 葡萄汁對(duì)大鼠體重、脾重、小腸長(zhǎng)度、脾臟及小腸長(zhǎng)度指數(shù)的影響(n=8) Table 1 Effect of grapes juice on weight，weight of spleen，length of small intestine and index of spleen and small intestine(n=8)

表3 葡萄汁對(duì)大鼠回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度、淋巴細(xì)胞數(shù)的影響(n=8)Table 3 Effect of grapes juice on villus height，crytp depth，lymphcytes in ileum(n=8)

由表1可知，與對(duì)照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠的體重和小腸長(zhǎng)度分別升高了15.5%和18.2%，且具有顯著性差異(p＜0.05)。兩組之間的脾重、脾臟指數(shù)、小腸指數(shù)均無(wú)顯著性差異。表明葡萄汁在一定程度上促進(jìn)了大鼠小腸的發(fā)育，小腸長(zhǎng)度的增長(zhǎng)可能與體重的增加有一定的關(guān)系。

2.3 葡萄汁對(duì)斷奶大鼠回腸中SOD活性、MDA含量變化的影響

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除超氧負(fù)離子自由基，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生水平，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織不受自由基的損害，延緩機(jī)體衰老過(guò)程［18］。丙二醛(MDA)為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度［19］，間接反映細(xì)胞損傷程度。

由表2可知，與對(duì)照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中的SOD活性升高了45%，差異顯著(p＜0.05)。葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中的MDA含量降低了47.3%，差異顯著(p＜0.05)。表明葡萄汁能提高斷奶大鼠腸道的抗氧化能力。

表2 葡萄汁對(duì)大鼠回腸中SOD、MDA的影響(n=8) Table 2 Effect of grapes juice on SOD，MDA in ileum(n=8)

2.4 葡萄汁對(duì)大鼠回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度、淋巴細(xì)胞數(shù)變化的影響

腸道是斷奶期動(dòng)物最容易受到影響的組織器官之一，絨毛高度與隱窩深度是反映腸道功能狀況的常用指標(biāo)。隱窩深度降低表明絨毛上皮成熟細(xì)胞增加，絨毛高度與隱窩深度的比值體現(xiàn)了小腸的消化吸收能力，可反映小腸的功能狀態(tài)［20］。

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，35d時(shí)葡萄汁組斷奶大鼠回腸末端絨毛高度高于對(duì)照組，隱窩深度更大(圖2)。與對(duì)照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠回腸絨毛高度、隱窩深度、淋巴細(xì)胞數(shù)分別升高了 22.1%、13.3%、8.3%，但均未造成顯著性差異(表3)。對(duì)照組和葡萄汁組的絨毛高度與隱窩深度比值分別為1.39和1.50，說(shuō)明葡萄汁干預(yù)后刺激了絨毛的生長(zhǎng)。結(jié)合兩組間體重增加的顯著性差異(表1)，說(shuō)明葡萄能增強(qiáng)斷奶大鼠小腸的吸收功能。

圖2 回腸末端HE染色的黏膜形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of terminal ileum mucous using histochemistry

3 討論

3.1 水果中所含有的生理活性物質(zhì)種類豐富，加上各種物質(zhì)的相互作用，其整體的功能作用及安全性可能強(qiáng)于單一的膳食補(bǔ)充劑［21］。Eberhardt等人［22］研究發(fā)現(xiàn)100g新鮮蘋果的抗氧化能力相當(dāng)于1500mg維生素C的抗氧化能力，當(dāng)含量50mg/mL時(shí)其抑制肝腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率可達(dá)57%。另有研究表明每天攝入500mg維生素C具有促氧化作用［23］。Castilla P等［24］研究發(fā)現(xiàn)紅葡萄汁比維生素E能更好的降低血總膽固醇和載脂蛋白B的含量，增加高密度脂蛋白膽固醇的含量。Décordé等［25］用蘋果、紫葡萄及其汁液干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠，發(fā)現(xiàn)它們均能顯著降低血漿總膽固醇和高密度膽固醇的含量，增強(qiáng)肝臟的抗氧化能力，且果汁的效果強(qiáng)于水果本身。因此通過(guò)膳食添加水果或其汁液對(duì)疾病的預(yù)防和緩解具有潛在的能力。

3.2 斷奶期的哺乳動(dòng)物免疫功能和胃腸道功能發(fā)育尚不健全，給嬰幼兒選擇功能性食品時(shí)其安全性更受人們的重視，因此添加富含生理活性物質(zhì)的食物來(lái)改善該時(shí)期嬰幼兒的不適癥狀，給預(yù)防和緩解斷奶期綜合征帶來(lái)了新思路。腸道是斷奶期動(dòng)物最容易受到影響的組織器官之一，其功能是否穩(wěn)定直接影響到動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育情況，本實(shí)驗(yàn)旨在探討葡萄汁對(duì)斷奶大鼠腸道發(fā)育的影響，及可能的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄汁對(duì)小腸發(fā)育有良好的促進(jìn)作用。斷奶應(yīng)激使腸道絨毛萎縮，隱窩深度變淺，從而影響斷奶動(dòng)物的消化吸收功能［26］。與對(duì)照組相比，葡萄汁干預(yù)后小腸長(zhǎng)度增加了18.2%，具有差異顯著性(p＜0.05)，絨毛高度和隱窩深度升高了22.1%和13.3%。葡萄汁不僅在一定程度上增加絨毛高度和隱窩深度，并能提高腸道的免疫功能，葡萄汁干預(yù)組腸道淋巴細(xì)胞數(shù)增加了8.3%。腸道絨毛高度，隱窩深度以及淋巴細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異性，可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)間有關(guān)。

3.3 研究表明斷奶容易造成腸道的氧化應(yīng)激，主要表現(xiàn)為抗氧化酶系的減少，以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的累積［27］，而氧化應(yīng)激可以直接影響腸道黏膜的結(jié)構(gòu)［28］。因此推測(cè)葡萄汁對(duì)腸道的保護(hù)作用可能與提高腸道的抗氧化能力有關(guān)。席鵬彬等人［29］研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺二肽能顯著提高斷奶仔豬血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超SOD活力。在仔豬的膳食中添加精氨酸或精氨酸生素能顯著降低腸道MDA的濃度，增加空腸谷胱甘肽的水平［30］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中SOD活性升高了45%，與對(duì)照組相比具有顯著差異性，MDA含量降低了47.3% (p＜0.05)。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在膳食中添加葡萄汁能促進(jìn)斷奶大鼠的小腸發(fā)育，這可能與提高小腸的抗氧化能力有關(guān)。今后可進(jìn)一步探索葡萄汁對(duì)斷奶期動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)，以及腸道微生物的影響，并進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)來(lái)探索最佳的使用劑量。

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Effect of grapes juice on antioxidant capacity and morphology of intestine in weaning rats

RUAN Zheng1，2，LIU Shi－qiang1，2，HUANG Xiao－liu1，2，ZHOU Yan1，2，OUYANG Chong－xue1，2，YIN Yu－long1，2，3，*(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang 330047，China;
2.College of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China;
3.Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China)

Objective:Study on the effect of grapes juice on small intestinal development in weaning rats.Method:16 weaning rats were randomly assigned to 2 groups as follows:normal control(NC)group and grape juice group.The weight of each rat at 0，7，14，21，35d and total food weight for every rat were recorded in every week.The weight of spleen and length of small intestine，the activity of superoxide dismutase(SOD)，the concentration of malonaldehyde(MDA)，morphology and lymphocytes in ileum were measured after all rats killed at 35d.Result:The weight，the growth rate of weight，length of small intestine and activity of SOD in ileum treated with grapes juice were significantly increased compared to rats in normal control group(p＜0.05)，and concentration of MDA in ileum was significantly lower respectively(p＜0.05).Conclusion:Grapes juice could improve growth of small intestine in weaning rats.

grape juice;weaning rats;small intestine;antioxidant capacity;morphology

TS218

A

1002－0306(2012)21－0340－05

2012－05－10 *通訊聯(lián)系人

阮征(1978－)，男，博士，副教授，研究方向:功能性食品及營(yíng)養(yǎng)代謝。

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青年骨干研究基金項(xiàng)目(SKLF－QN－201110);國(guó)家自然科學(xué)基金(31001014)。