PMA- LAMP方法檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的研究

胡惠秩，滿朝新，董鑫悅，劉珊珊，薛玉清，楊士芹，謝鯤昊，劉 穎，盧 雁，姜毓君，，*

(1.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;

2.東北農業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

PMA- LAMP方法檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的研究

胡惠秩1，滿朝新2，董鑫悅1，劉珊珊1，薛玉清1，楊士芹1，謝鯤昊1，劉 穎1，盧 雁2，姜毓君1，2，*

(1.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;

2.東北農業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

近年來，金黃色葡萄球菌引起的食品安全事件頻發(fā)，這就需要建立一種快速準確地檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法。傳統(tǒng)方法檢測食品中金黃色葡萄球菌活菌存在很多缺點。由于細胞死亡后其DNA依然能夠存活許久，所以傳統(tǒng)方法不能有效區(qū)分DNA來自死菌還是活菌。通過熒光染料PMA與快速檢測技術LAMP相結合的方法快速、靈敏的檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌，并對死/活菌進行區(qū)分。根據金黃色葡萄球菌nuc基因設計引物，并對LAMP反應體系及PMA－LAMP方法進行優(yōu)化，同時優(yōu)化了滅菌乳中提取DNA的方法。在純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中，PMA－LAMP方法檢測靈敏度為3.2CFU/mL，PMA－PCR方法的檢測靈敏度為3.2×102CFU/mL;對人工污染滅菌乳中的金黃色葡萄球，PMA－LAMP方法檢測靈敏度為5×101CFU/mL，而PMA－PCR方法檢測靈敏度為5×103CFU/mL。整個反應需要大約6h，說明PMA－LAMP方法檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌特異性強、靈敏度高、時間短且操作簡便，有望成為快速檢測金黃色葡萄球菌活菌的新方法。

PMA－LAMP，金黃色葡萄球菌，乳，檢測

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)廣泛分布于自然界中，食品受污染的機會很多，是引起食物中毒的主要致病菌之一，同時也是引起奶?；既榉垦椎闹匾≡＝陙?，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件頻發(fā)［1－2］。因此，建立一種快速、準確的檢測方法對預防和控制金黃色葡萄球菌的感染具有重要意義。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌生物檢測方法存在很大缺陷，檢測時間較長。近年來，一些基因水平的檢測方法，如PCR方法和RT－PCR方法［3－6］，由于在檢測病原菌方面快速、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點，已經顯示出長遠的發(fā)展前景。然而，由于這些檢測方法靈敏度低，需要精密的儀器和特殊的試劑及檢測擴增產物時方法復雜［7］。這些因素在一定程度上限制了傳統(tǒng)核酸擴增方法在食品安全檢測中的應用。環(huán)介導等溫擴增技術(Loop－Mediated Isothermal Amplification，簡稱 LAMP)是日本學者Notomi等［8］在2000年研發(fā)的一種新型的核酸擴增技術。因其高效、特異、操作簡便、快速等優(yōu)點，目前已在食品安全檢測、臨床醫(yī)學和生物學等領域中應用［9－11］。環(huán)境中細胞失去生存能力后，其DNA依然具有持續(xù)生存能力，則基于DNA的檢測方法不能區(qū)分陽性信號是來自靶微生物中的活細菌還是死細菌，就可能導致對病原菌風險的過高估計或得出假陽性結果。在食品檢測方面，基因水平的檢測方法往往高估了樣品中活菌的水平。疊氮溴化丙錠(PMA)和疊氮溴化乙錠(EMA)是兩種對DNA具有高度親和力的DNA熒光染料，不能透過完整的細胞膜(壁)，只能選擇性地通過不完整的死細胞［12－14］。用PMA和EMA處理后的樣品暴露于可見光下，所帶的光敏性稷氮基團轉化為高活性的氮賓中間體，與死細胞DNA形成不可逆的共價鍵，致使DNA不能發(fā)生擴增反應;同時，那些留在溶液中沒有與DNA分子進行交聯的PMA和EMA在強光照射的同時與水分子反應生成沒有活性的羥胺［15］。由于EMA具有細胞毒性并且不穩(wěn)定，使其應用受到較大的限制。因此，建立一種以無細胞毒性的PMA與LAMP技術相結合，應用于牛乳中金黃色葡萄球菌活細胞的選擇性檢測方法有重要意義。

表1 實驗所用菌株、來源及PMA－LAMP方法特異性的檢測結果Table 1 Bacterial strains used in this study，their sources and results of PMA－LAMP assay

1 材料與方法

1.1 材料與儀器本研究所用標準實驗菌株分別來自美國典型菌種保藏中心(ATCC)和中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)，分離株由本實驗室分離保存，詳見表1。金黃色葡萄球菌ATCC13565作為檢測靈敏度和優(yōu)化實驗的標準菌株，其他三株金黃色葡萄球菌(ATCC25923，CMCC26074，CMCC26075)和26株致病菌用來進行特異性檢測。Bst DNA Polymerase

New England Biolabs公司;Taq DNA Polymerase、甜菜堿(betaine)、SYBR Green I Sigma公司;細菌基因組

DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術有限公司;PMA 美國Biotium公司;LAMP及PCR引物 上海英俊生物技術有限公司。

表2 金黃色葡萄球菌nuc基因擴增引物序列Table 2 Sequences of LAMP and PCR primers

1.2 培養(yǎng)條件

實驗所用的金黃色葡萄球菌接種于20mL NB液體培養(yǎng)基中，搖床200r/min 37℃培養(yǎng)8h。其他菌種分別接種于20mL復合增菌培養(yǎng)基BPW中，按照每種細菌最適生長溫度培養(yǎng)過夜，吸取1mL培養(yǎng)菌液，提取細菌基因組DNA。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌基因組DNA及牛乳中DNA的提取 本研究采用試劑盒法快速提取基因組DNA。牛乳中DNA的提取主要為:樣品中加入DNA提取液，在蛋白酶K及溶菌酶的作用下，37℃振蕩3h。之后加入SDS，在55℃條件下水浴。離心之后將上清液轉入新的離心管中，在沉淀中加入DNA提取液和SDS。在渦旋振蕩器上振蕩之后，合并所有的上清液，加入氯仿∶異戊醇進行離心，回收水相，棄掉上清液，加入TE緩沖液溶解DNA。

1.3.2 LAMP引物設計與合成及樣品處理 根據nuc基因的6個特定的不同區(qū)域，利用LAMP引物設計軟件PrimerExplorerV4設計4條引物:兩條外引物F3和B3及兩條內引物FIP和BIP。靈敏度對比實驗，基于nuc基因序列，利用PrimerExpress V3.0軟件設計，LAMP及PCR引物序列見表2，引物由上海英俊生物技術有限公司合成。PMA溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成1mg/mL的PMA溶液，－20℃避光保存。取1mmL制備好的菌懸液置于1.5mL微量離心管中，加入3μL 1mg/mL的PMA溶液，使PMA的終質量濃度為3μg/mL;PMA與菌懸液混合均勻后在室溫條件下避光培養(yǎng)5min，利用鹵素燈曝光5min，光照交聯時樣品置于冰上(避免過熱)，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用于DNA的提取。

1.3.3 反應體系 LAMP體系為50μL，由10× ThermoPoL Buffer 5μL、2.5mmol·L－1dNTP 8μL、100mmol·L－1MgSO44μL、40mmol·L－1FIP 2μL、40mmol·L－1BIP 2μL、10mmol·L－1F3 1μL、10mmol·L－1B3 1μL、10mmol·L－1甜菜堿6μL、8U·μL－1Bst DNA Polymerase 2μL、金黃色葡萄球菌基因組DNA模板2μL組成。PCR法反應體系為 50μL:10×PCR Buffer 5μL、引物為 Nuc－1、Nuc－2各 2μL、dNTP 5μL、Taq DNA Polymerase 2μL、金黃色葡萄球菌基因組DNA模板4μL，加ddH2O至50μL。

1.3.4 金黃色葡萄球菌熱處理致死條件的優(yōu)化 本研究選擇熱處理的方法致死菌體，按照1.2的方法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，取出后在無菌條件下移入離心管中，6000r/min離心15min收集菌體，再用滅菌的0.85%的生理鹽水重新懸浮菌體，根據OD值調節(jié)菌液濃度達到5×108CFU/mL，分裝為1mL，置于水浴鍋中，95°C分別加熱1、2、3、4、5min，然后迅速放置冰上，涂于固體平板上16h后觀察是否有菌落生成，確定最佳致死時間。

1.3.5 曝光時間的優(yōu)化 按照1.3.4方法中得到的最佳熱致死時間，將制備好的1mL死菌懸液加入PMA使終濃度為5μg/mL，實驗分為6組，一組不加PMA處理，另外五組加PMA處理。黑暗下孵育10min，然后用650W鹵素燈照射曝光，曝光時間分別為1、3、5、7、10min，之后置于距離光源20cm處，以上操作均在冰上進行，防止溫度過高。最后用LAMP對其模板DNA進行擴增，來確定最佳曝光時間。

1.3.6 孵育時間的優(yōu)化 前期菌液制備同上，制備好的1mL死菌懸液加入PMA使終濃度為5μg/mL，實驗分為6組，一組不加PMA處理，另外五組加PMA處理。參考文獻，處理組黑暗下孵育時間分別選為3、4、5、8、10min，然后在650W鹵素燈下曝光，樣品置于距離光源20cm處，以上操作均在冰上進行，防止溫度過高。最后用LAMP對其模板DNA進行擴增，來確定最佳曝光時間。

1.3.7 PMA濃度的優(yōu)化 按照1.2的方法培養(yǎng)菌種，調整菌液濃度為5×108CFU/mL。按照1.3.4的方法致死菌體，分裝活菌液和死菌液各1mL。活菌液中加入PMA使終濃度分別為0、1、3、5、10、20、50、100μg/ mL，按上述實驗得到的最佳熱致死時間、最佳曝光時間及孵育時間進行處理，將菌液涂于固體平板上進行平板計數。死菌液中加入PMA使終濃度為0、0.5、1、2、3、4、5、8、10μg/mL。避光孵育3min，曝光5min，提取菌體DNA進行LAMP實驗以確定PMA對死菌的影響。以上操作均在冰上進行，防止溫度過高。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌LAMP方法的建立

以金黃色葡萄球菌nuc基因為靶基因，設計4條引物，以試劑盒提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，在Bst DNA Polymerase作用下LAMP擴增，61℃水浴作用60min，反應結束后目測觀察擴增效果。實驗結果見圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳驗證結果顯示，陽性反應管中發(fā)生LAMP擴增反應，出現典型的LAMP擴增電泳條帶，而陰性對照組未發(fā)生反應。

圖1 LAMP方法的建立Fig.1 Establish the system of LAMP

2.2 PMA處理菌體條件的優(yōu)化

從表3可知，當PMA濃度大于3μg/mL之后，對活菌的生長產生抑制;當濃度達到50μg/mL時，活菌大部分被抑制;當濃度達到100μg/mL時，活菌全部被殺死。這些說明PMA具有一定的殺菌作用，所以，樣品在進行PMA處理時，不適合選取過高濃度，會對實驗結果產生影響。當PMA濃度小于3μg/mL時處理死菌，有擴增條帶出現，說明部分死菌的DNA沒有與PMA結合，從而能夠進行擴增。當PMA濃度增大到3μg/mL時，無擴增條帶出現，說明此時PMA的濃度能充分與死菌結合，抑制其DNA擴增(由于篇幅限制，圖表未列出)。所以，根據致死時間、孵育時間及曝光時間的優(yōu)化實驗結果，我們最后選擇PMA處理的濃度為3μg/mL，最佳致死時間為5min，最佳孵育時間為3min，最佳曝光時間為5min。

表3 PMA濃度對活菌的影響Table 3 Different PMA concentrations on the impact of viable Staphylococcus aureus

2.3 PMA-LAMP檢測金黃色葡萄球菌方法的建立

從優(yōu)化的結果中得到了完整的PMA處理菌體的反應條件，所以PMA－LAMP方法結合的體系基本建立，需進一步驗證。分別取1mL濃度為5×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌活菌液和死菌液，加入PMA至終濃度為3μg/mL，暗處放置3min，然后在距650W鹵素燈20cm處曝光5min。整個過程都在冰上進行，以防止溫度過高。同時分別取1mL未經PMA處理的活菌液和死菌液作為對照。將上述菌液用細菌基因組DNA提取試劑盒提取其 DNA，以此為模板進行LAMP反應。從圖2中可以看出，泳道二至泳道四都有梯形條帶產生，泳道五沒有條帶產生，說明泳道二至泳道四發(fā)生LAMP擴增。由此可知，3μg/mL濃度的PMA能夠完全抑制5×108cfu/mL的死菌DNA的擴增，但不能抑制相同濃度的活菌DNA的擴增。經PMA處理的活菌與未經PMA處理的活菌的LAMP擴增結果一致。因此，PMA－LAMP方法能夠有效地抑制死菌的擴增，使其只檢測活菌，從而防止產生假陽性結果。

圖2 PMA－LAMP方法的建立Fig.2 Establish the system of PMA－LAMP for detection Staphylococcus aureus

2.4 PMA-LAMP檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度

為了分析PMA－LAMP方法的檢測靈敏度，取菌體濃度為3.2×108CFU/mL的菌液按1∶1的比例混合活菌和死菌，10倍梯度稀釋，之后用PMA處理，分別提取其DNA后經LAMP擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察，結果見圖3。為了與PMA－LAMP方法的靈敏度進行比較，取前述提取的DNA作為模板進行PCR反應，結果未顯示，PMA－LAMP方法的靈敏度比PMA－PCR方法的靈敏度高100倍。

圖3 PMA－LAMP方法的靈敏度Fig.3 PMA－LAMP detection sensitivity of Staphylococcus aureus

2.5 PMA-LAMP方法應用于滅菌乳中金黃色葡萄球菌的檢測

本研究選擇滅菌乳作為模擬實際受檢樣品，乳中沒有金黃色葡萄球菌，符合污染條件，然后人工添加金黃色葡萄球菌于滅菌乳中，使乳中活菌濃度為5×107CFU/mL，十倍梯度稀釋，用PMA進行處理之后，將上述1.3.1方法提取的DNA作為模板，進行LAMP反應，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果如圖4所示。該PMA－LAMP方法對滅菌乳中細菌樣本經過108倍稀釋后提取的DNA模板進行驗證，仍能有效擴增，說明該方法對滅菌乳中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為5×101CFU/mL。為了與PMA－LAMP檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的靈敏度進行比較，本研究用上述的DNA作為模板進行PCR擴增反應，結果未顯示，PMA－PCR檢測靈敏度為5×103CFU/mL，比PMA－LAMP方法檢測靈敏度低100倍，結果未顯示。

圖4 PMA－LAMP方法檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的靈敏度Fig.4 Agarose gel electrophoresis of detection limit of Staphylococcus aureus in Sterilized milk using PMA－LAMP reaction

2.6 PMA-LAMP檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的特異性

將4株金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC13565、ATCC25923、CMCC26112、CMCC26074和其他26株常見致病菌，按照1.3.1方法進行處理得到DNA后，進行LAMP特異性檢測，檢測結果見表1所示:4株金黃色葡萄球菌全部檢出，其他26株致病菌的檢測全部呈陰性，說明PMA－LAMP檢測方法具有良好的特異性。

3 結論

金黃色葡萄球菌在人類居住的環(huán)境中分布廣泛，尤其是牛乳、肉、蛋類等食品中易受其污染。我國每年因金黃色葡萄球菌食物中毒事件也頻頻發(fā)生，人們生活受到嚴重影響［16］。本研究采用PMALAMP方法對金黃色葡萄球菌nuc基因進行檢測，nuc基因編碼的耐熱核酸酶(Thermostable nuclease，Thermonuclease［TNase］)，是一種細胞外酶，由致病性菌株產生。不僅為金黃色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之間具有較高的保守性［17－18］，廣泛用于金黃色葡萄球菌的檢測［19－20］。全部檢測時間大約是6h，包括從人工污染的滅菌乳中提取DNA 4h，PMA處理時間及LAMP反應時間大約1.5h，瓊脂糖凝膠電泳檢測時間0.5h;而用傳統(tǒng)的PCR及熒光PCR方法進行檢測至少需要一天的時間，并且設備投入高，不易推廣使用。通過對30株常見致病菌進行PMALAMP擴增，所試的4株金黃色葡萄球菌均為陽性結果，說明PMA－LAMP方法具有高度特異性。同時，該方法具有較高的檢測靈敏度，PMA－LAMP方法對純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌檢測靈敏度為3.2CFU/mL，PMA－PCR方法的檢測靈敏度為3.2×102CFU/mL;對人工污染滅菌乳中的金黃色葡萄球菌PMA－LAMP方法檢測靈敏度為5×101CFU/mL，而PMA－PCR方法檢測靈敏度為5×103CFU/mL，PMA－LAMP方法的檢測靈敏度比PMA－PCR方法高2個數量級。本研究同時優(yōu)化了乳中提取 DNA的方法，在 Meiri－Bendeck［21］等人研究的基礎上進行了改進，使得提取效果更顯著，提取過程更省時。總之，本研究建立的金黃色葡萄球菌PMA－LAMP方法具有高度靈敏性和特異性，不需要使用精密昂貴的實驗設備，操作簡單，適合基層檢驗檢疫機構推廣使用。

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Detecting of viableStaphylococcus aureusby loop－mediated isothermal amplification coupling with propidium monoazide in dairy products

HU Hui－zhi1，MAN Chao－xin2，DONG Xin－yue1，LIU Shan－shan1，XUE Yu－qing1，
YANG Shi－qin1，XIE Kun－h(huán)ao1，LIU Ying1，LU Yan2，JIANG Yu－jun1，2，*
(1.Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;
2.National Dairy Engineering Research Center，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In recent years，the increasing number ofStaphylococcus aureusoutbreaks linked to food product highlighted the need to develop technique with rapid，simple and accurate.The conventional technologies for rapid and sensitive detection ofS.aureusviable cells in produce had several limitations.The signal from viable versus dead cells could not be distinguished due to the persistence of DNA after the cell death，resulting in overestimate the number of cells.In the present study，some problems had been solved by developing a new concept with DNA－intercalating dye propidium membrane(PMA)combining with loop－mediated isothermal amplification(LAMP).The test was used to analyseS.aureusand routine dairy products.a series of primers targeted six distinct sequences of nuc gene were designed，which was characteristic ofS.aureus.Also，the LAMP assay and the performance of PMA－LAMP for detecting viableS.aureuswere optimized.Moreover，they improved the method for extraction DNA from dairy samples.In pure culture，the detection limit of PMA－LAMP was 3.2CFU/mL，up to 100－fold more sensitive than PCR.In dariy products，PMA－LAMP assay could detect as less as 5×101CFU/mL compared to that of PCR－PMA was 5×103CFU/mL.The complete LAMP－PMA assay for took about 6h，demonstrating the method was rapid and convenient.In conclusion，PMA－LAMP offers a novel DNA－based detection method for distinction between viable and dead cells with wide application in food products.

PMA－LAMP;Staphylococcus aureu;dairy;detection

TS207.3

A

1002－0306(2012)21－0300－06

2012－03－16 *通訊聯系人

胡惠秩(1985－)，女，碩士，研究方向:食品微生物與生物技術。

國家科技支撐計劃項目(2012BAK17B04)。