產(chǎn)高活性木聚糖酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

滕 超，紀(jì) 燁，李秀婷，*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048;

2.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

產(chǎn)高活性木聚糖酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

滕 超1，2，紀(jì) 燁1，李秀婷1，*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048;

2.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

本研究采用平板透明圈法自土樣中篩選出產(chǎn)木聚糖酶放線菌52株，其中酶活100U/mL以上的有12株。對其中產(chǎn)木聚糖酶酶活較高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株F4712(初始酶活349.4U/mL)進(jìn)行了液體發(fā)酵條件優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)首先對培養(yǎng)基成分包括碳源(種類及添加量)、氮源(種類及添加量)及發(fā)酵條件:溫度、發(fā)酵初始pH、搖床轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵時(shí)間等因素進(jìn)行了考察。通過Box－Behnken響應(yīng)面分析對發(fā)酵產(chǎn)酶條件做進(jìn)一步優(yōu)化，確定了搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為玉米芯水不溶性木聚糖(2.8%)，酵母浸膏(0.5%)及蛋白胨(1.0%)、45℃、pH6.2、130r/min以及6d。在此條件下酶活達(dá)693.4U/mL(較優(yōu)化前提高了98.5%)。

放線菌，木聚糖酶，篩選，優(yōu)化

廣義木聚糖酶是指能夠降解木聚糖的一組酶的統(tǒng)稱，包括β－1，4－外切木聚糖酶，β－1，4－內(nèi)切木聚糖酶和β－木糖苷酶［1］。木聚糖酶作為酶制劑行業(yè)中的一個(gè)重要產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于食品、造紙、飼料及紡織等多個(gè)行業(yè)［2］。這也是不斷篩選新型酶源的重要意義所在。已發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶種類繁多而且廣泛存在于海洋及陸地，但因?yàn)楂@得難易程度及純度的原因，當(dāng)前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物發(fā)酵獲得［3］。已報(bào)道產(chǎn)木聚糖酶的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌、木霉、曲霉、青霉等。而國內(nèi)外研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌、曲霉、木霉所產(chǎn)的木聚糖酶［4］，放線菌(Actinomycete)作為原核生物的一個(gè)主要類群，雖然菌株產(chǎn)木聚糖酶水平略低于曲霉和木霉，但通常并不分泌纖維素酶，因此其具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值［5］。國內(nèi)關(guān)于放線菌產(chǎn)木聚糖酶的報(bào)道較少，僅有的報(bào)道主要集中在放線菌中的鏈霉菌屬。孫迅等［6］分離并篩選了一株產(chǎn)胞外木聚糖酶活力高的鏈霉菌(Streptomycessp.Strz－6)，酶活力為9.8U/mL;孫曉霞等［7］報(bào)道一株白色鏈霉菌(Streptomyces albus)產(chǎn)木聚糖酶活性為45.7 U/mL。李娥等［8］對鏈霉菌L2001利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果木聚糖酶活力達(dá)498.8U/mL，為當(dāng)前類似研究報(bào)道的較高水平。國外報(bào)道的鏈霉菌產(chǎn)木聚糖酶活力平均水平相對較高，Maheswari等［9］篩選的Strepto－myces cuspidosporus產(chǎn)木聚糖酶水平為146.0U/mL。Beg等［10］考察了Streptomycessp.QG－11－3產(chǎn)木聚糖酶的情況，優(yōu)化后發(fā)酵水平可達(dá)到203.0U/mL。為了進(jìn)一步開發(fā)和豐富產(chǎn)木聚糖酶放線菌的菌種來源，本實(shí)驗(yàn)對木聚糖酶高產(chǎn)放線菌株進(jìn)行了高通量篩選，并對其中一株產(chǎn)酶較高菌株(F4712)的發(fā)酵條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察，對影響產(chǎn)酶水平的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺木木聚糖 美國Sigma公司;酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、3，5－二硝基水楊酸、碳酸鈉、干酪素、羧甲基纖維素鈉等 均為國產(chǎn)分析純試劑;平板培養(yǎng)基(g/L) 酵母浸膏2，蛋白胨3，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀6，磷酸氫二鉀1.5，瓊脂20，玉米芯水不溶性木聚糖(200目)10，121℃滅菌20min;液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)碳源15，酵母浸膏5，蛋白胨10，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀6，磷酸氫二鉀1.5，121℃滅菌20min;菌種保藏斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

超凈工作臺(tái)VD－1320 北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;電子分析天平JA5003 上海天平廠;生化培養(yǎng)箱LRH－250 上海一恒科技有限公司;恒溫?fù)u床HQ45 中科院武漢科學(xué)儀器廠;pH酸堿度計(jì)PHS－3D Thermo公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初篩方法 稱取四川、貴州等地土樣，分別用無菌水稀釋至合適倍數(shù)，涂布于平板培養(yǎng)基上，40℃培養(yǎng)2～3d，利用透明圈法對產(chǎn)木聚糖酶菌株進(jìn)行初篩。將疑似菌株于40℃條件下進(jìn)行埋片培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后分別取出埋片，用光學(xué)顯微鏡初步觀察菌絲形態(tài)，對其進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化 250mL錐形瓶裝液量50mL，接種后40℃、140r/min、初始pH6.0進(jìn)行培養(yǎng)。在此基礎(chǔ)上考察碳源種類(纖維素、淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、玉米芯水不溶性木聚糖、麥皮、棉籽殼、玉米芯等，添加量為1.5%)，碳源粒度(40、60、80、100、200目)，碳源濃度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)，氮源種類［硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、尿素、牛肉蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸膏、胰蛋白胨、酵母提取物、復(fù)合氮a(酵母浸膏1.0%+牛肉蛋白胨0.5%)、復(fù)合氮b(酵母提取物1.0%+牛肉蛋白胨0.5%，濃度為1.5%)］，培養(yǎng)基的初始 pH (4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)，轉(zhuǎn)速(120、140、160r/min)，溫度(30、35、40、45、50℃)以及發(fā)酵時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6、7d)對菌株產(chǎn)酶水平的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定影響木聚糖酶活的主要因素分別為A、B、C，根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.4 木聚糖酶活力測定 木聚糖酶活力的測定參照DNS法［11］。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design

1.2.5 纖維素酶、蛋白酶活力的測定 對于產(chǎn)木聚糖酶的菌株一般并不希望其產(chǎn)其它糖化酶，因此實(shí)驗(yàn)對菌株產(chǎn)纖維素酶的情況進(jìn)行了考察。纖維素酶活力測定方法參照高潤池等方法［12］。為考察菌株是否產(chǎn)蛋白酶而導(dǎo)致木聚糖酶降解，實(shí)驗(yàn)對菌株產(chǎn)蛋白酶的情況進(jìn)行了考察。蛋白酶活力的測定參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527－2009進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)木聚糖酶放線菌的篩選

實(shí)驗(yàn)采用透明圈法從土樣中篩選出產(chǎn)木聚糖酶，確定平板透明圈較大的52株放線菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示酶活力在100.0U/mL以上的有12株。

表2 產(chǎn)木聚糖酶放線菌初篩Table 2 Prescreening of Actinomycetes with xylanase activity

對發(fā)酵酶活較高的菌株進(jìn)行反復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)菌株F4712產(chǎn)木聚糖酶較高且穩(wěn)定性較好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以 F4712作為研究對象，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件。

2.2 放線菌F4712產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

2.2.1 碳源種類對菌株產(chǎn)酶的影響 大部分木聚糖酶均為誘導(dǎo)性酶，因此碳源種類會(huì)直接影響菌株的產(chǎn)酶效果，實(shí)驗(yàn)考察了11種碳源對菌株產(chǎn)酶水平的影響，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，菌株在以單糖及二糖為碳源發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)酶水平普遍較低(小于10U/mL)。相比而言，利用含木聚糖農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶時(shí)酶活較高(以棉籽殼及玉米芯為發(fā)酵碳源時(shí)酶活分別達(dá)到48.3U/mL及32.0U/mL)，但酶活仍低于50U/mL并且伴有纖維素酶的產(chǎn)生(約為木聚糖酶活力的8%)，同時(shí)結(jié)果也顯示了在天然纖維質(zhì)材料中木聚糖的利用方面，此菌株與一些真菌還存在一定差距［13］。實(shí)驗(yàn)顯示玉米芯木聚糖為最佳誘導(dǎo)碳源，其誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力遠(yuǎn)高于其它碳源，發(fā)酵酶活達(dá)到345.9U/mL。由于不同的農(nóng)業(yè)廢棄物中所含的木聚糖的種類和結(jié)構(gòu)一般會(huì)存在著較大的差異，并且菌株利用結(jié)合態(tài)及游離態(tài)木聚糖的能力也有不同，這可能是導(dǎo)致不同碳源誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶能力存在明顯差別的主要原因［14－15］。

表3 碳源種類對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Table 3 Effect of different carbon sources on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.2 碳源粒度對菌株產(chǎn)酶的影響 碳源粒度有可能直接影響微生物對碳源的分解程度和利用效果，因此實(shí)驗(yàn)在確定玉米芯木聚糖為最佳碳源后，繼續(xù)考察碳源粒度對菌株產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1所示。

圖1 碳源粒度對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.1 Effect of carbon source partical sizes on xylanase production by Actinomycete F4712

由圖1可知，在玉米芯粒度為80目時(shí)，酶活力達(dá)到最大值364.9U/mL，比碳源粒度為40、60、100和200目時(shí)分別高出56%、17%、23%和31%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示較大或較小的碳源顆粒均不適合菌株的誘導(dǎo)利用。

2.2.3 碳源濃度對菌株產(chǎn)酶的影響 碳源的主要作用是供給菌種生命活動(dòng)所需要的能量以及作為構(gòu)成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物中的來源，為微生物生長提供所需能量和構(gòu)建細(xì)胞骨架。因此碳源濃度一般會(huì)直接影響對木聚糖酶的誘導(dǎo)效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

從圖2可知，隨著碳源濃度的增加，發(fā)酵液中木聚糖酶量逐漸增加，當(dāng)碳源濃度為2.5%時(shí)木聚糖酶活力達(dá)到最大為466.73U/mL。而后隨著碳源濃度繼續(xù)升高，木聚糖酶活力開始降低。碳源濃度太低不利于菌株的生長及碳源對木聚糖酶的誘導(dǎo)，而碳源濃度過高則會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，因此選擇2.5%為實(shí)驗(yàn)的碳源濃度。

圖2 碳源濃度對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on xylanase production by Actinomycete F4712

圖3 氮源種類對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.4 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響 氮源不僅是菌體生長所必需的，而且是合成酶本身的前體來源，影響著酶的合成與分泌。一般來說，有機(jī)氮源培養(yǎng)要優(yōu)于無機(jī)氮源［16］，但也有部分微生物利用無機(jī)氮源的能力要高于有機(jī)氮源［17］。實(shí)驗(yàn)在確定碳源種類、粒度及添加量后，繼續(xù)考察氮源種類對菌株產(chǎn)酶效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均可以使菌體生長和產(chǎn)酶，但相較而言有機(jī)氮源則更有利于菌體的生長和木聚糖酶的合成。以單一有機(jī)氮源為發(fā)酵氮源進(jìn)行考察時(shí)，以酵母提取物為氮源時(shí)產(chǎn)酶效果最佳為431.0U/mL，牛肉蛋白胨和酵母浸膏次之;無機(jī)氮源中硝酸鈉為最佳氮源，而以硫酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)酶最低。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶由于可以引起木聚糖酶的迅速降解，成為制約木聚糖酶發(fā)酵及儲(chǔ)存的一個(gè)重要因素。因此實(shí)驗(yàn)同時(shí)也測定了發(fā)酵液中的蛋白酶活力，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無論是無機(jī)氮源還是有機(jī)氮源均不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，復(fù)合氮源的產(chǎn)酶效果要高于單一氮源，菌株在以復(fù)合氮源b為發(fā)酵氮源時(shí)木聚糖酶活達(dá)到675.7U/mL，高于以復(fù)合氮源a為氮源的產(chǎn)酶水平。但考慮到發(fā)酵成本等問題(酵母浸膏比酵母提取物相對廉價(jià))，實(shí)驗(yàn)選擇復(fù)合氮源 a(酵母浸膏1.0%+牛肉蛋白胨0.5%)為培養(yǎng)基組成氮源。

圖4 初始pH對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.5 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基初始pH不僅會(huì)影響到細(xì)胞膜所帶的電荷，改變培養(yǎng)基中化合物的離子化程度，同時(shí)還有可能改變某些化合物分子進(jìn)入細(xì)胞的狀態(tài)，進(jìn)而影響菌株的生長狀態(tài)及產(chǎn)酶水平。實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化完培養(yǎng)基碳氮源種類及含量后，繼續(xù)考察培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基的初始pH對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響很大。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放線菌F4712在pH4.5的酸性條件下雖然可以生產(chǎn)，但是酶的合成受到了明顯抑制。隨著培養(yǎng)基初始pH的提高，菌株發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力也隨之增高，當(dāng)pH介于5.5～6.5時(shí)比較利于菌株合成木聚糖酶，在pH6.0時(shí)，木聚糖酶活力達(dá)到最大值為612.09U/mL。然后隨著pH升高，木聚糖酶活力開始下降，當(dāng)pH達(dá)到8.0時(shí)，酶活力僅為最高值的10%左右。另外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為4.5或大于7.5時(shí)，菌株生長狀態(tài)較差。而當(dāng)pH介于5.5～6.5時(shí)，菌株生長旺盛，發(fā)酵液比較粘稠，此結(jié)果說明該菌株在培養(yǎng)基為中性偏弱酸時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酶效果高。因此選擇合適初始pH對獲得較好的產(chǎn)酶效果至關(guān)重要。

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響 搖床轉(zhuǎn)速的高低直接影響發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中溶氧的多少，繼而影響菌的生長狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)考察了搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.5 Effect of rotation rate on xylanase production by Actinomycete F4712

由圖5可知，搖床在140r/min的條件下，菌株產(chǎn)木聚糖酶的效果最大，酶活力達(dá)到592.7U/mL，分別比120r/min和160r/min時(shí)產(chǎn)木聚糖酶的效果高20%和31%。

2.2.7 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響 在確定最佳碳氮源、培養(yǎng)基初始pH和轉(zhuǎn)速的條件下，考察溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。培養(yǎng)溫度過低和過高均會(huì)影響菌株的生長，培養(yǎng)溫度過低，菌體生長緩慢且發(fā)酵時(shí)間長，產(chǎn)酶效果低;而溫度過高會(huì)導(dǎo)致菌體生長過于迅速，菌絲體很容易老化，同樣不利于木聚糖酶的合成和分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.6 Effect of temperature on xylanase production by Actinomycete F4712

由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株所產(chǎn)木聚糖酶酶活逐漸增加，在發(fā)酵溫度為40、45℃時(shí)發(fā)酵酶活分別達(dá)到600.7U/mL及660.9U/mL。繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度，酶活力迅速下降。

2.2.8 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響 實(shí)驗(yàn)在確定所有發(fā)酵條件后，最后對菌株F4712的產(chǎn)酶歷程進(jìn)行了考察和確定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶影響Fig.7 Effect of incubation time on xylanase production by Actinomycete F4712

前期實(shí)驗(yàn)顯示菌株在溫度40、45℃時(shí)產(chǎn)酶效果相當(dāng)，因此實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了菌株在這兩個(gè)溫度下的產(chǎn)酶歷程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株在兩個(gè)溫度下產(chǎn)酶趨勢類似，同樣在發(fā)酵第6d時(shí)達(dá)到最大值。其中在發(fā)酵溫度為45℃時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最大值675.0U/mL。另外，實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵瓶壁自培養(yǎng)的第3d開始有淡藍(lán)色的菌絲附著，隨著時(shí)間延長附著菌絲越來越厚，發(fā)酵液也越來越粘稠。至發(fā)酵第6d發(fā)酵酶活停止增長且之后略有下降。

2.3 放線菌F4712產(chǎn)酶條件響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出碳源濃度、培養(yǎng)基初始pH和搖床轉(zhuǎn)速分別為影響菌株產(chǎn)木聚糖酶活力的三個(gè)重要因素，并按照Box－Behnken設(shè)計(jì)法每個(gè)因素取三個(gè)水平，以(－1，0，1)編碼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。三因素三水平共17組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表4。

根據(jù)表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用用Design Expert7.1.3軟件進(jìn)行方差分析和二次回歸擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，回歸方程變量分析表見表5。

以Y木聚糖酶活力(U/mL)為響應(yīng)面值，以A (碳源濃度)、B(pH)、C(轉(zhuǎn)速)為自變量，擬合得到多元二次回歸方程:Y=618.40+123.50A+30.63B－103.88C+64.50AB+87.00AC+15.25BC－111.07A2－96.32B2－75.33C2。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表及方差分析可知，模型實(shí)驗(yàn)擬合良好，模型的p=0.0001＜0.05，表明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著，失擬項(xiàng)p=0.0721＞0.05，說明方程對實(shí)驗(yàn)的擬合度較好，此方法可靠。表5表明各因素對木聚糖酶活力的影響不同，其中碳源濃度的影響最大，其次是轉(zhuǎn)速的影響，均達(dá)到極顯著水平，培養(yǎng)基初始pH對木聚糖酶活力無顯著影響;AB、AC對木聚糖酶活力效應(yīng)顯著，而BC交互作用不顯著。A2、B2、C2對Y值的影響達(dá)極顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大的關(guān)系。模型的R2=0.9712，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小。

表5 回歸方程變量分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

表4 放線菌F4712產(chǎn)木聚糖酶的Box－Behnken design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Experiment design and results of the Box－Behnken design for xylanase production

由圖8可知，在搖床轉(zhuǎn)速(140r/min)一定的條件下，木聚糖酶活力隨碳源濃度的增加和初始培養(yǎng)基pH的減少而先增加后減少，兩者交互作用顯著，且碳源濃度對木聚糖酶活力的影響比初始培養(yǎng)基pH顯著。

圖8 碳源濃度和培養(yǎng)基初始pH交互作用因素間交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of the combined effects (concentration of corncob and initial pH)

由圖9可知，在初始培養(yǎng)基pH(6.0)一定的條件下，木聚糖酶活力隨碳源濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，而隨搖床轉(zhuǎn)速的降低而增加，并達(dá)到一定酶活力后變化趨于平緩。兩者交互作用顯著。由圖10可知，在碳源濃度(2.5%)一定的條件下，木聚糖酶活力隨培養(yǎng)基初始pH的增加呈先增加后減少的趨勢，而隨搖床轉(zhuǎn)速的降低而增加，并達(dá)到一定酶活力后變化趨于平緩。

圖9 碳源濃度和搖床轉(zhuǎn)速交互作用的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of the combined effects (concentration of corncob and rotation rate)

對回歸方程求解可知木聚糖酶活力的最佳優(yōu)化條件是:碳源濃度2.75%，初始培養(yǎng)基pH 6.15，搖床轉(zhuǎn)速為132.55r/min，此時(shí)模型預(yù)測的最大木聚糖酶活力值為672.911U/mL。對模型驗(yàn)證(為操作方便取最佳參數(shù)為:碳源濃度2.8%，初始培養(yǎng)基pH6.2，搖床轉(zhuǎn)速為130r/min)，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定木聚糖酶酶活為693.4U/mL與預(yù)測值偏差2.95%，無顯著差異。酶活力值較原始培養(yǎng)條件下酶活提高了98.5%。

圖10 培養(yǎng)基初始pH和搖床轉(zhuǎn)速交互作用的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of the combined effects (initial pH and rotation rate)

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)收集稱取四川、貴州等地幾十份土樣，通過透明圈法篩選出一株產(chǎn)酶效果高的放線菌F4712。對菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素及響應(yīng)面優(yōu)化，確定鏈霉菌F4712最佳產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件為:最適碳源為80目玉米芯水不溶性木聚糖(2.8%)，最適氮源為牛肉蛋白胨(1.0%)+酵母浸膏(0.5%)，最適培養(yǎng)基初始pH為6.2，最適搖床轉(zhuǎn)速為130r/min及最適培養(yǎng)溫度為45℃。在此條件下培養(yǎng)6d，木聚糖酶的活力達(dá)693.4U/mL，較初始酶活提高98%以上。

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Screening of high－yield xylanase－producing Actinomycetesp.and optimization of its fermentation conditions

TENG Chao1，2，JI Ye1，LI Xiu－ting1，*
(1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;
2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology＆Business University(BTBU)，Beijing 100048，China)

52actinomyceteswere isolated from the soil samples of different districts of China based on plate screening method，and 12 strains was obtained with enzyme activity over 100U/mL.ActinomyceteF4712 with high xylanase－producing(the initial enzyme activity was 349.4U/mL)was selected for further research.The conditions including:carbon source，nitrogen source，initial pH value，rotation rate，temperature and cultivation time were investigated by single－factor experiment.Box－Behnken was utilized to the response surface analysis to determine the conditions further，which were insoluble corncob xylan 2.8%，a combination of beef peptone 1.0%and yeast extract 0.5%，pH 6.2，130r/min，45℃and 6 days.The xylanase activity was 693.4U/mL under the optimal conditions，which was improved by 98.5%compared to the original activity.

actinomyces;xylanase;screening;optimization

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0172－06

2012－03－26 *通訊聯(lián)系人

滕超(1981－)，男，博士，講師，研究方向:食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071511);北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃資助項(xiàng)目(PHR 20110872)。