活細胞傳感儀在嗜酸乳酸桿菌培養(yǎng)過程中的應(yīng)用

羅艷霞，黃明志，郭元昕，王澤建，儲 炬

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室，國家生化工程技術(shù)研究中心，上海 200237)

活細胞傳感儀在嗜酸乳酸桿菌培養(yǎng)過程中的應(yīng)用

羅艷霞，黃明志*，郭元昕，王澤建，儲 炬

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室，國家生化工程技術(shù)研究中心，上海 200237)

活細胞是嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵過程的目標產(chǎn)物，但長期以來一直缺乏一種能快速、準確地檢測發(fā)酵液中活細胞量的方法，本文引入了一種基于電容原理的活細胞量測量新方法，探討了其在嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程中在線應(yīng)用的可行性。研究結(jié)果表明，活細胞傳感儀測定的活細胞數(shù)與平板活菌計數(shù)法測定的菌體濃度有非常好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達0.9944，在相同的實驗條件下，儀器測定數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性，基于電容值計算出的比生長速率比基于CER、OUR計算出的比生長速率更可信。因此活細胞傳感儀為嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程在線監(jiān)測提供了一種簡便、精確的方法。

活細胞傳感器，電容，嗜酸乳桿菌

發(fā)酵過程最本質(zhì)的特征在于通過細胞代謝活動來實現(xiàn)目標產(chǎn)物的生產(chǎn)，大量具有代謝活性的細胞及適宜的培養(yǎng)環(huán)境是發(fā)酵過程得以高效進行的前提條件。在發(fā)酵過程的檢測和控制參數(shù)中，溫度、溶氧(DO)、pH等參數(shù)描述了細胞所處的培養(yǎng)環(huán)境，而細胞量直接反映了細胞的數(shù)量，對發(fā)酵過程有著更為重要的影響。目前細胞量的測定方法可分為離線和在線兩大類。常見的離線測定法有:菌體干重(DCW)、吸光度、離心體積(PMV)和平板計數(shù)等。但這些離線方法費時費力，容易受實驗條件者等外界因素影響，測定的細胞量僅能大致反映菌體生長趨勢，不易發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中關(guān)鍵時刻活菌體濃度的變化。因此，近些年國內(nèi)外提出了多種活細胞濃度在線測定儀器，主要有原位顯微鏡法［1］、近紅外光譜法［2］、激光散射分析法［3］、熒光分析法［4］、電容法和電阻法［4］等。其中電容法測量受細胞組成形式、氣泡及不溶性物質(zhì)等因素的影響比較小，已成功被應(yīng)用于多個生物過程中，如酵母菌［5－7］、鏈霉菌［8］、CHO［9］、枯草芽孢桿菌［10］和干酪乳桿菌［11］等。嗜酸乳桿菌是一種益生菌，被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，是一種活菌制劑，對其質(zhì)量除了要符合食品和藥品的一般要求外，從生產(chǎn)到儲存保質(zhì)期內(nèi)的每個環(huán)節(jié)，都是以最大限度的保存活菌數(shù)為目標［12］。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程中細胞生長快速、生產(chǎn)周期短，而目前常用的平板計數(shù)法耗時較長，測量結(jié)果出來時培養(yǎng)過程往往已經(jīng)結(jié)束，難以應(yīng)用到工藝控制和優(yōu)化上，因此研究出一種能在線監(jiān)測培養(yǎng)過程中細胞量的方法，對提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量顯得非常重要。本論文將電容法活細胞傳感儀應(yīng)用到嗜酸乳酸桿菌補料分批高密度培養(yǎng)過程中，并與其它常見細胞量測定法比較，對這種方法的重復(fù)性和其它在線表現(xiàn)菌活力的方法相關(guān)性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白胨 MERCK公司;酵母粉 OXOID公司;葡萄糖 華北制藥康欣有限公司;番茄 當?shù)厥袌?MRS OXOID公司;嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilusYIJ2004) 上海信誼藥廠有限公司提供。

JJ1000型精密電子天平 美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠;FA004型電子天平 上海愛平儀器有限公司;潔凈工作臺 上海匯龍儀表電子有限公司;TDL－80－2B型低速離心機 南京以馬內(nèi)利儀器廠;TGL－16B型高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海華連醫(yī)療器械有限公司;721S型可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;活細胞傳感儀BIOMASS MONITOR 220型 英國ABER公司;GX－2生物量濃度在線檢測儀 南寧安勝達科技有限公司;過程氣體質(zhì)普分析儀MAX300－LG Eextrel，USA;15L發(fā)酵罐FUS－15L

上海國強生化工程裝備有限公司;BIORADAR軟件包 國家生化工程技術(shù)研究中心，生物過程軟件“發(fā)酵之星”華東理工大學(xué)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 皰肉管培養(yǎng)基配方為(g/L):蛋白胨30，酵母膏5，葡萄糖3，牛肉浸液1000，可溶性淀粉2，磷酸二氫鈉5，碎肉渣適量，pH7.6(用NaOH調(diào));種子培養(yǎng)基配方為(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉6，葡萄糖16，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉5，Twen80 1mL，番茄汁200mL，pH7.0(用NaOH調(diào));發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨16，酵母粉15，葡萄糖2，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂0.1，硫酸亞鐵0.01，硫酸錳0.01，乙酸鈉 5，Twen80 1mL，番茄汁200mL，pH7.0(用NaOH調(diào))。

1.2.2 番茄汁制備 番茄洗凈后打碎，煮沸0.5h左右，用八層紗布過濾。

1.2.3 牛肉渣制備 當?shù)厥袌鲑徶门Ｈ?，去脂肪絞碎，1kg加2L水，煮沸2h，過濾，濾液制成牛肉浸液，濾渣用清水漂洗，泡24h，濾去水，濾渣80℃烘干備用。

1.2.4 皰肉管制備 按1.2.1配方配制皰肉管培養(yǎng)基，用NaOH調(diào)pH7.6，吸取7mL液體裝入有15× 150刻度的玻璃試管，用棉塞塞好后包扎，121℃滅菌15min。

1.2.5 培養(yǎng)條件 皰肉管培養(yǎng)條件:挑單菌落接入按1.2.4制好的皰肉管中，37℃靜置培養(yǎng)18～24h;種子培養(yǎng)條件:按1.2.1配方，配800mL種液，分裝兩個500mL搖瓶，121℃滅菌20min，冷卻后，吸取皰肉管種子液5mL接入種子瓶中，37℃靜置培養(yǎng)14h;發(fā)酵培養(yǎng)條件:15L發(fā)酵罐裝液量8L，接種量10%，溫度30℃，通氣量1～3L/min，培養(yǎng)時間14h。pH通過自動流加25%NaOH溶液進行調(diào)節(jié)，葡萄糖通過流加500g/L的葡萄糖控制2～5g/L。

1.3 測定方法

1.3.1 干重測量 取10mL發(fā)酵液裝入10mL離心管中，8000r/min離心10min，再用去離子水清洗2次，直至洗掉發(fā)酵液中的殘?zhí)?，然后將試管連同固體一起放到80℃烘箱中烘至恒重。

1.3.2 OD600測量 取一定量發(fā)酵液，8000r/min離心10min，取得上清液稀釋發(fā)酵液至適當倍數(shù)后，在波長600nm下測量吸光值。

1.3.3 平板活菌計數(shù)(cfu/mL) 發(fā)酵液稀釋至適當倍數(shù)后，涂MRS平板，37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)。

1.3.4 還原糖測定 DNS法［13］。

1.3.5 活細胞數(shù)分析 采用Biomass Monitor 220檢測發(fā)酵過程中活細胞濃度。電容法在線活細胞傳感儀測定活細胞數(shù)的原理可參見其它文獻［14］。電容(Cap)和電導(dǎo)率單位分別用pF/cm和mS/cm表示，可通過將該儀器電極插到15L發(fā)酵罐中，121℃滅菌消毒后在線測得。Biomass Monitor 220儀器可采用多頻測量，頻率范圍0.1～10MHz，通過高低頻率下分別測得的發(fā)酵液電容值，便可計算出發(fā)酵液電容值，電導(dǎo)范圍1～100mS/cm，幾乎涵蓋了所有發(fā)酵的電導(dǎo)率范圍。

1.3.6 細胞量在線分析 采用GX－2生物量濃度在線檢測儀，利用光密度法(OD)原理，測得的OD值與總細胞量成正比。

1.3.7 氣體成分分析 發(fā)酵過程中排出氣體的O2和CO2含量分別用過程氣體質(zhì)譜分析儀MAX300－LG測定，通過生物過程軟件“發(fā)酵之星”進行處理，在線計算二氧化碳生成速率CER、氧氣消耗速率OUR等間接參數(shù)。

1.3.8 在線參數(shù)處理 發(fā)酵罐用BIORADAR軟件包控制，提供直接參數(shù)(如:O2、CO2等)與間接參數(shù)(比如氧氣消耗速率(OUR)、二氧化碳生成速率(CER)、呼吸商(RQ)等)的在線檢測與控制(圖略)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件優(yōu)化

因為發(fā)酵培養(yǎng)基沒有不溶物，根據(jù)儀器說明書，確定為單頻模式。細菌低通濾波值范圍一般在30～60之間，本文考察了低通濾波值為30、40、50條件下電容基線和噪音大小，發(fā)現(xiàn)LPF為40時基線噪聲小。取對數(shù)期發(fā)酵液，離線條件下進行全頻掃描，確定使用頻率為1200kZ。

為了確定嗜酸乳桿菌分批補料高密度培養(yǎng)過程中電容值信號確實是對菌體的響應(yīng)，在發(fā)酵結(jié)束后后，將發(fā)酵液8000r/min，離心10min，棄菌體，再用活細胞傳感儀測定上清液，離心前后電容值和電導(dǎo)率的變化見圖1。

由圖1可以看出，離心后，上清液電容值由1.75pF/cm降低至接近為零，而電導(dǎo)率基本不變，為28.6mS/cm左右。由此可見，嗜酸乳桿菌分批補料過程中，用Biomass Monitor 220測定發(fā)酵液電容值反映了活菌數(shù)的變化。

2.2 電容值與活細胞量之間對應(yīng)關(guān)系

按1.2.5條件發(fā)酵，在屬于細胞對數(shù)生長期內(nèi)的4～11h內(nèi)分別取樣按1.3.1法離線測定細胞干重，結(jié)果見表1。

表2 電容法測定電容值(Cap)與CFU、DCW、OD600nm及在線OD法測定的菌體濃度間線性關(guān)系方程Table 2 Linear relationship between capacitance(Cap)and biomass concentration estimated by CFU，DCW，OD600nmor OD method

圖1 發(fā)酵液離心前后電容和電導(dǎo)率變化Fig.1 Changes of capacitance and conductivity in fermentation liquid before and after the centrifugation

表1 對數(shù)期菌體干重與電容的關(guān)系Table 1 The relationship of DCW and Cap in Logarithmic phase

將離線測定的菌體干重與在線測定的電容值進行線性回歸，得到式(1):

DCW=2.5915×Cap－0.4607 式(1)

其相關(guān)系數(shù)為0.9934，可見在研究的范圍內(nèi)，活細胞傳感儀測量出的電容值能準確地反映活細胞量變化。

2.3 電容法與其它常見的測定方法的比較

將電容法在線測定的菌體濃度與其它常見的菌體濃度離線測定法(比如OD600nm、干重、平板活菌計數(shù))和在線光密度法(在線OD)進行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 在線電容法與離線干重、OD600nm、CFU及在線光密度法測定菌體濃度比較Fig.2 Comparison of biomasses estimated by on－line capacitance measurement and off－line biomass determination of dry cell weight，cell optical density at 600nm wavelength，number of colony forming units or on－line optical density

由圖2可以看出，在線電容法測定菌體濃度(Cap)與其它離線和在線測定菌體濃度法都能描述菌體生長的大致趨勢，但當開始進入穩(wěn)定期(10h后)，DCW、OD600nm及在線 OD與 CFU、Cap偏離，DCW、OD600nm及在線OD在持續(xù)上升，而CFU、Cap經(jīng)過短暫上升后有所下降，這是由于進入穩(wěn)定期后，菌體生成緩慢，總活菌數(shù)變化不大，但總菌體量還在增長。

細胞電容值(Cap)與各離線法和在線光密度法測定菌濃線性關(guān)系見表2。

由表2看出Cap與CFU具有很好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達到0.994。因此活細胞傳感儀可用于在線監(jiān)測嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程中活細胞數(shù)，了解細胞生長代謝狀況、指示放罐時機是一種簡便可行的方法。

2.4 數(shù)據(jù)重復(fù)性考察

按1.2.2的方法，在相同的培養(yǎng)條件下，重復(fù)三批實驗，對測定電容值進行分析，結(jié)果見表3。

表3 相同發(fā)酵條件下，三批干重與電容值線性相關(guān)方程Table 3 Linear relationship between Capand DCW measurements in three fermentations using the same growth conditions

由此可以看出干重和電容值線性相關(guān)重復(fù)性很好，平均線性相關(guān)方程見式(2)。因此在線活細胞傳感儀，是一種非常可信的方法。

2.5 比生長速率在線估計

電容法在線活細胞傳感儀測定發(fā)酵液的電容值與活細胞數(shù)成正比，可用于在線計算比生長速率［15］。基于電容法計算出的比生長速率(μ)可通過式(3)計算。

式(3)中常數(shù)a為菌體濃度與電容之間的系數(shù)，可離線測定。在不同的生物過程中OUR、CER和菌量存在一定的關(guān)系［16］，OUR(CER)=XQ，假設(shè)活細胞的呼吸強度Q是一樣的，那么OUR、CER和活細胞量之間也存在正比關(guān)系。比生長速率可分別用式(4)和式(5)計算。

發(fā)酵過程中，基于電容、CER、和OUR進行估計的比生長速率變化如圖3所示。

圖3 電容法、OUR和CER估計的比生長速率Fig.3 The specific growth rate estimate by Cap，OUR or CER

從圖3可以看出發(fā)酵過程中比生長速率(μ)不斷波動，基于CER、OUR計算的比生長速率比基于電容估算的比生長速率波動較大。是由于活細胞傳感儀測定的活細胞數(shù)僅受菌體濃度和菌體大小影響，而受培養(yǎng)環(huán)境如氣泡、不溶物等外界環(huán)境因素影響較小，而雖然過程質(zhì)譜儀分析的精度也很高，但菌體培養(yǎng)過程中，菌體的呼吸強度受補料、濃氧、pH等外界條件的變化影響比較大。所以基于電容估算的比生長速率更可信，可為以后嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程提供更可靠和精確的控制策略。

2.5 結(jié)合活細胞量在線測定的嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程參數(shù)相關(guān)分析

圖4是按1.2.2條件進行發(fā)酵實驗，嗜酸乳桿菌補料分批發(fā)酵過程參數(shù)變化曲線圖。

圖4 嗜酸乳桿菌補料分批發(fā)酵過程各參數(shù)變化曲線Fig.4 Time course of Fed－batch fermentation of Lactobacillus acidophilus

由圖4可以看出，發(fā)酵開始經(jīng)過3h左右的生長適應(yīng)期后，開始進入對數(shù)生長期，菌體快速生長，活細胞量濃度迅速增加，耗糖量、消耗葡萄糖產(chǎn)生的二氧化碳量和二氧化碳釋放速率都同步快速增加。到5h左右，活細胞量有一段緩慢生長期，二氧化碳生成量和二氧化碳釋放速率突然降低，這是由于碳源不足，限制了菌體生長，因此從這時開始補加葡萄糖，進行補料分批發(fā)酵培養(yǎng)?；罴毎繚舛壤^續(xù)增加，電容值繼續(xù)升高，從12h左右開始，菌體生長進入了穩(wěn)定期，電容值維持不變，因為活細胞量濃度緩慢增加后基本維持不變，二氧化碳生成量和二氧化碳釋放速率快速下降，碳源充足。由此可見，電容值更好地描述了整個發(fā)酵過程中活細胞量的變化情況，這為嗜酸乳桿菌培養(yǎng)工藝的控制和優(yōu)化提供了良好的條件。

3 結(jié)論

本文探討了在嗜酸乳桿菌這培養(yǎng)過程中應(yīng)用電容原理的活細胞傳感儀在線監(jiān)測活細胞量的可行性。研究結(jié)果表明，電容法測定活細胞數(shù)與平板活菌計數(shù)測定菌體濃度法有很好的線性對應(yīng)關(guān)系，且相同的實驗條件下，儀器測定結(jié)果重復(fù)性比較好。在比生長速率的估算中，基于電容法估算出的比生長速率比基于CER、OUR估算出的比生長速率更可信。綜上所述，活細胞傳感儀可用于在線檢測嗜酸乳桿菌分批補料高密度培養(yǎng)過程中活細胞數(shù)，從而使我們能更好地了解菌體生長代謝狀況、指示放罐時機等，為以后嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程提供了一個方便可信的在線監(jiān)測手段。

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The application of viable cell mass monitoring inLactobacillus acidophiluscultivation

LUO Yan－xia，HUANG Ming－zhi*，GUO Yuan－xin，WANG Ze－jian，CHU Ju
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

Viable cell is the final products ofLactobacillus acidophilusfermentation process.However，at present，there is no efficient method to monitor it on－line quickly and accurately.In this paper，a new method that based on the capacitive principle for on－line monitoring viable－cell mass was employed.As a result，the relationship between the number of colony forming units(CFU)and capacitance with a correlation coefficient(R)of 0.9944 was achieved and data showed a good reproducibility under the same culture conditions.Simultaneously，compared with those determined by indirect online estimation methods including oxygen uptake rate(OUR)and carbon dioxide evolution rate(CER)，the specific growth rate estimated by on－line capacitance measurement could be more reliable duringLactobacillus acidophilusfermentation process.Therefore，it could be concluded that a capacitance probe was a simple as well as a accurate tool inLactobacillus acidophiluscultivation process.

viable－cell mass monitoring;capacitance;Lactobacillus acidophilus

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0152－05

2012－03－27 *通訊聯(lián)系人

羅艷霞(1985－)，女，碩士，研究方向:益生菌培養(yǎng)工藝過程優(yōu)化與放大。

十二五“科技支撐計劃”(2011BAF02B03);國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021201);十二五“973”項目(2012CB721006)。