臨床合并應(yīng)用鎮(zhèn)靜催眠藥對(duì)阿司匹林酯酶活性的影響

王鴻梅，李 軍

(1.齊都醫(yī)院，山東 淄博255400;2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床藥理中心，山東濟(jì)南250021)

心腦血管疾病患者由于對(duì)疾病的擔(dān)憂、生活環(huán)境與節(jié)律改變、服用影響睡眠的抗高血壓及治療心血管病的藥物以及冠心病本身都可導(dǎo)致患者入睡困難。病人在失眠狀態(tài)下常誘發(fā)焦慮和恐懼情緒使病情加重，臨床常采用鎮(zhèn)靜催眠藥來(lái)改善病人的睡眠狀態(tài)。阿司匹林通過(guò)不可逆的抑制環(huán)氧化酶－1(COX－1)的活性，從而發(fā)揮抗血小板聚集的作用，臨床常用于預(yù)防心腦血管并發(fā)癥和相關(guān)疾病。而阿司匹林在吸收過(guò)程中和吸收后會(huì)迅速地被存在于血漿、肝臟及胃粘膜中的阿司匹林酯酶水解為水楊酸而失去抗血小板聚集的作用［1］。本研究的目的是探討鎮(zhèn)靜催眠藥與阿司匹林合用時(shí)是否存在代謝性相互作用，以指導(dǎo)阿司匹林臨床個(gè)體合理化給藥，保證用藥的安全性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 10Avp型高效液相色譜儀，SCL－10AVP中央控制器、LC－10ATVP高壓泵、SIL－10ADVP自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD－10AVP紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、CLASS－VP5.0色譜數(shù)據(jù)工作站(日本Shimadzu公司)。TGL－16G低溫高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，SHZ－82水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，低溫冰箱(海爾科技有限公司)，漩渦振蕩器。

1.2 藥品與試劑 阿司匹林對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100113－200302)、水楊酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100113－200302)、非那西丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100113－200302);磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào):20030601);異丙醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào):20030802);乙腈(色譜純，天津市西華特種試劑開(kāi)發(fā)廠，批號(hào):20050818);咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，5 mg·mL－1，批號(hào):2009701);苯巴比妥鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司，0.1 g·mL－1，批號(hào):0807182);氯硝西泮注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，批號(hào):1004232);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 精密稱取80.21 mg阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品，用 0.01 mol·L－1鹽酸定容至 100 mL，得到 800.0 mg·L－1阿司匹林儲(chǔ)備液，并用0.01 mol·L－1的鹽酸稀釋成濃度為12、24、48、96、192、384、768 mg·L－1的系列溶液，4 ℃冰箱保存。

精密稱取60.00 mg水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至100 mL，得到600.0 mg·L－1的水楊酸儲(chǔ)備液。并用水稀釋成濃度為15、30、60、90、150、300、600 mg·L－1的對(duì)照品系列溶液。

非那西丁(內(nèi)標(biāo))水溶液為5 mg·L－1。

2.2 血漿阿司匹林酯酶的體外培養(yǎng) 精取200 μL人空白血漿，加入20 μL的1 mmol·L－1阿司匹林溶液，藥物溶液適量(加或不加)，后以Tris緩沖培養(yǎng)液(200 mmol·L－1CaCl2，20 mmol·L－1Tris－ HCl，pH7.4)補(bǔ)足 3 mL［2］?；靹?30 s后放置37℃的水浴搖床中振蕩20 min，加入50 μL非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩混勻后吸取0.5 mL于離心機(jī)試管中加入等體積0.5 mL的乙腈，旋渦振蕩30 s(沉淀蛋白，中止反應(yīng))，以12 000 r·min－1離心 5 min 后，吸取上清液 20 μL，用HPLC測(cè)定。

2.3 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C8柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);島津Shim － pack C18預(yù)柱;流動(dòng)相為乙腈 －1‰磷酸鹽緩沖液(V/V)=22∶78，用前經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)并經(jīng)超聲脫氣;流速為1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為20 μL。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 取空白血漿按上述血漿樣品處理項(xiàng)操作，色譜圖見(jiàn)圖1，阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)溶液、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖2，未加藥物的樣品處理后的色譜圖見(jiàn)圖3。

在選定的色譜條件下，血漿中物質(zhì)不影響阿司匹林、水楊酸和內(nèi)標(biāo)非那西丁的分離、測(cè)定，阿司匹林峰、內(nèi)標(biāo)峰與水楊酸峰分離良好。添加的藥物不影響阿司匹林和水楊酸的測(cè)定，但苯巴比妥峰與內(nèi)標(biāo)峰重合，計(jì)算時(shí)采用外標(biāo)法，其他兩種藥物對(duì)內(nèi)標(biāo)峰不影響采用內(nèi)標(biāo)法。樣品中阿司匹林、內(nèi)標(biāo)非那西丁與水楊酸的保留時(shí)間分別為9.47 min、12.17 min和 14.10 min。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 阿司匹林、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 未加藥物的樣品處理后的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 取7支試管加入培養(yǎng)緩沖液2.780 mL，然后分別加入水楊酸和阿司匹林對(duì)照品系列濃度溶液，各支均加入0.2 mL空白血漿使水楊酸和阿司匹林在培養(yǎng)緩沖液中的最終濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、4 mg·L－1和 0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mg·L－1，從“加入50 μL非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液”起，按血漿阿司匹林酯酶的體外培養(yǎng)項(xiàng)下進(jìn)行操作。以測(cè)得水楊酸和阿司匹林對(duì)照品與非那西丁內(nèi)標(biāo)的峰面積之比對(duì)濃度(mg·L－1)進(jìn)行直線回歸，得水楊酸和阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:

水楊酸:Y=1.830 1X －0.060 1(r=0.999 0)。

阿司匹林:Y=1.598X －0.034 6(r=0.999 8)。

結(jié)果表明，血漿中水楊酸在0.05～4 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，血漿中阿司匹林在0.08～5.12 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 最低檢測(cè)濃度 在上述色譜條件下，以引起3倍于噪聲的被測(cè)藥物進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限，水楊酸、阿司匹林最低檢測(cè)限都為 50 μg·L－1。

3.4 精密度試驗(yàn) 取阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下低(24 mg·L－1)、中(96 mg·L－1)、高(384 mg·L－1)三種濃度和水楊酸標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下低(30 mg·L－1)、中(90 mg·L－1)、高(300 mg·L－1)三種濃度，從上述“加入50 μL非那西丁溶液”起，按血漿阿司匹林酯酶的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行操作，1 d內(nèi)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度和每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，阿司匹林和水楊酸的日內(nèi)、日間精密度均符合要求。

表1 阿司匹林和水楊酸測(cè)定的日內(nèi)精密度和日間精密度(x ± s，n=5)

3.5 回收率試驗(yàn) 分別在加入200 μL空白血漿和不加空白血漿的2.780 mL 培養(yǎng)液中按濃度 30、90、300 mg·L－1加入水楊酸，按濃度 24、96、384 mg·L－1加入阿司匹林，混勻后，從“加50 μL非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液”起，按血漿阿司匹林酯的體外培養(yǎng)方法進(jìn)行操作后進(jìn)樣，將兩組峰面積比，計(jì)算相應(yīng)的提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2見(jiàn)，阿司匹林和水楊酸的提取回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。

表2 阿司匹林和水楊酸的提取回收率(x ± s，n=5)

3.6 咪達(dá)唑侖、苯巴比妥和氯硝西泮對(duì)阿司匹酯酶活性的影響，見(jiàn)表3。

表3 鎮(zhèn)靜催眠藥對(duì)阿司匹林酯酶活性影響結(jié)果(x ± s，n=5)

由表3可見(jiàn)，咪達(dá)唑侖對(duì)阿司匹林酯酶的活性有一定的抑制作用，抑制率為27.94%。苯巴比妥和氯硝西泮能促進(jìn)阿司匹林酯酶的活性，促進(jìn)率為8.83%和0.66%，但氯硝西泮的數(shù)據(jù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

4 討論

合并用藥是臨床用藥的常見(jiàn)手段，藥物間可能發(fā)生的相互作用會(huì)引起藥效、藥物動(dòng)力學(xué)等變化，有時(shí)甚至引起嚴(yán)重的毒副作用，如抗組胺藥特非那丁(Terfcnadine)與酮康唑合并用藥會(huì)引發(fā)一些病人嚴(yán)重心律不齊而導(dǎo)致生命危險(xiǎn)。代謝性藥物相互作用(Metabolic Drug Interaction)是指兩種或兩種以上藥物在同時(shí)或者是前后序貫用藥時(shí)，在代謝環(huán)節(jié)產(chǎn)生相互作用。結(jié)果使療效增強(qiáng)甚至產(chǎn)生毒副作用，或療效減弱甚至治療失?。?］。由于代謝是大多數(shù)藥物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)重要的環(huán)節(jié)之一。因此，代謝性藥物相互作用具有重要的臨床意義。

臨床常用咪達(dá)唑侖、苯巴比妥和氯硝西泮等鎮(zhèn)靜催眠藥來(lái)減輕心腦血管疾病患者的焦慮和恐懼情緒，改善患者的睡眠狀態(tài)。阿司匹林用于冠心病患者可減少高危患者心肌梗死、心源性猝死、腦卒中的危險(xiǎn)性［4］。但有部分個(gè)體存在著阿司匹林抵抗現(xiàn)象，不能從阿司匹林中獲益。最近研究評(píng)價(jià)了不同心血管疾病患者服用常規(guī)劑量阿司匹林(75～325 mg·d－1)預(yù)防心腦血管并發(fā)癥和相關(guān)疾病再發(fā)的療效。結(jié)果顯示，28%患者出現(xiàn)阿司匹林抵抗。阿司匹林抵抗的機(jī)制尚不清楚，其原因較多［5］，如基因多態(tài)性、環(huán)氧化酶的過(guò)度表達(dá)、血小板的旁路激活途徑以及藥物的相互作用等。鎮(zhèn)靜催眠藥與阿司匹林合用時(shí)會(huì)影響阿司匹林代謝，藥物間的代謝性相互作用對(duì)阿司匹林療效的影響尤為重要。

本研究采用HPLC法測(cè)定血漿中阿司匹林(ASA)及水楊酸(SA)的濃度，以SA/(SA+ASA)的比值表示阿司匹林酯酶的活性。該方法為本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的體外培養(yǎng)法和熒光測(cè)定法所建立的新方法［6］，為本研究的順利完成奠定了基礎(chǔ)，也為國(guó)內(nèi)外開(kāi)展阿司匹林酯酶活性的研究開(kāi)拓了一種新方法。結(jié)果顯示，苯巴比妥能促進(jìn)阿司匹林酯酶的活性，促進(jìn)率為8.83%。Puche等［7］報(bào)道了苯巴比妥能誘導(dǎo)患者血漿阿司匹林酯酶的活性，可增強(qiáng)阿司匹林代謝且無(wú)性別差異。苯巴比妥為強(qiáng)藥酶誘導(dǎo)劑，能增強(qiáng)阿司匹林酯酶的活性，使體內(nèi)阿司匹林代謝加快，原型藥物代謝增多降低了其藥理作用，從而降低療效，故不建議二者聯(lián)用。必須聯(lián)用時(shí)可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整藥物劑量，既要保證療效又要避免不良反應(yīng)的發(fā)生。咪達(dá)唑侖對(duì)阿司匹林酯酶的活性有一定的抑制作用，抑制率為27.94%。即其能減慢阿司匹林代謝為水楊酸，使阿司匹林的藥效相對(duì)增強(qiáng)，療效增大，不良反應(yīng)發(fā)生率也可相應(yīng)增加，合并用藥時(shí)應(yīng)注意。Dundee等［8］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以明顯縮短咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜的時(shí)間，使患者盡快地進(jìn)入鎮(zhèn)靜狀態(tài)。由上可知，不僅咪達(dá)唑侖與阿司匹林合用可以增強(qiáng)阿司匹林的藥效，反之，阿司匹林也可以縮短咪達(dá)唑侖生效的時(shí)間，合用時(shí)應(yīng)適當(dāng)調(diào)整藥物的劑量。本研究結(jié)果顯示氯硝西泮能促進(jìn)阿司匹林酯酶的活性，促進(jìn)率為10.81%，但是無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。氯硝西泮可能不會(huì)影響與之合用的需阿司匹林酯酶代謝的阿司匹林的臨床療效。長(zhǎng)期或者大劑量使用氯硝西泮對(duì)阿司匹林酯酶的影響值得進(jìn)一步研究。

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