醋艾葉飲片HPLC指紋圖譜研究暨異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定

周 倩，孫立立，于鳳蕊

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250014)

艾葉來源于菊科植物艾Artemisia argyi levl.et Vant.的干燥葉［1］，艾葉主要含有揮發(fā)油類、黃酮類、鞣質(zhì)類和三萜類等化學(xué)成分，具有散寒止痛，溫經(jīng)止血之功效，是婦科常用藥。雖然艾葉的野生資源較為豐富，臨床用量較大，但關(guān)于艾葉的研究報(bào)道卻為數(shù)很少。另外，有的地區(qū)以野艾A.lavandulaefolia DC.葉作艾葉入藥，但野艾葉療效遠(yuǎn)差于艾葉［2］。2010版藥典通過測定艾葉中桉油精的含量來控制生品艾葉質(zhì)量，但是桉油精的含量受產(chǎn)地、采集時(shí)間和儲存時(shí)間的影響較大［3，4］。課題組通過研究發(fā)現(xiàn)艾葉經(jīng)醋炙后桉油精含量顯著降低，更無法作為醋艾葉的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。

中藥指紋圖譜能比較全面的反映中藥中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，從而反映中藥的質(zhì)量［5］，目前對醋艾葉指紋圖譜的研究未見報(bào)道，尤其在現(xiàn)階段艾葉的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，采用中藥指紋圖譜的方式，可以更全面反映其所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而控制其質(zhì)量。植物黃酮在心血管、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛以及消化系統(tǒng)等方面均有一定的藥理作用，艾葉黃酮是艾葉的主要活性物質(zhì)，其中的異澤蘭黃素［6］(5，7 － 二羥基 －6，3'，4'－ 三甲氧基黃酮)對血小板聚集有顯著的抑制作用，是艾葉止血、抗凝血的活性成分，各產(chǎn)地艾葉中異澤蘭黃素含量未見報(bào)道。

為更好的控制醋艾葉質(zhì)量，本文收集了10個(gè)批次醋艾葉飲片進(jìn)行測定，建立了HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出14個(gè)共有特征指紋峰，可為醋艾葉的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)，采用指紋圖譜色譜條件，同時(shí)對活性成分異澤蘭黃素進(jìn)行了含量測定，并同時(shí)測定了棕矢車菊素的含量，均可作為指標(biāo)性成分控制艾葉質(zhì)量。為有效區(qū)分艾葉和野艾，本研究同時(shí)收集了野艾醋炙品，與正品醋艾葉進(jìn)行了指紋圖譜及異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量比較，結(jié)果，二者指紋圖譜有所不同，野艾醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量均顯著低于醋艾葉，可明顯區(qū)別二者，為臨床用藥的有效性提供了保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測器，1/10萬電子天平(Sartorius R200D，德國)。LC－350A超聲波中藥處理機(jī)(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠)。

1.2 試藥 本研究收集了11批不同產(chǎn)地的艾葉，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定，樣品S－11為野艾，其余均為菊科植物艾的干燥葉。棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品由實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC檢測純度大于98%。乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純。樣品產(chǎn)地來源見表1。將各批艾葉制備為醋艾葉飲片，方法如下:將輔料醋與適量水混勻，淋入凈艾葉飲片中拌勻，悶潤，220℃炒制28 min，取出，晾涼。100 kg艾葉用醋15 kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈(B)－0.2%甲酸(A)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表2;檢測波長330 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:25 ℃。

表1 樣品產(chǎn)地來源信息表

2.2 對照品溶液的制備 取棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品分別為40 μg、60 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取各供試品粉末0.5 g，精密稱定，精密加入80%甲醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，放涼，再次稱重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取樣品S－3醋艾葉供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。以異澤蘭黃素的色譜峰為參照峰，計(jì)算各特征指紋峰的相對保留時(shí)間和相對保留峰面積。結(jié)果，各共有特征指紋峰的相對保留時(shí)間的RSD值在0.01%～1.81%，相對保留峰面積在 0.66% ～2.89%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品S－3粉末5份，照“2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法”制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣并記錄指紋圖譜。結(jié)果，各共有特征指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD值分別在0.01% ～0.91%、0.11% ～2.64%之間，表明本方法重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將室溫下放置的樣品S－3的供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜。結(jié)果，各共有特征指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD值分別在0.01% ～0.90%、0.08% ～2.86% 之間，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 混合對照HPLC圖譜

圖2 醋艾葉對照指紋圖譜

2.6 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

圖310 批醋艾葉HPLC圖譜(R為生成的對照圖譜)

2.6.1 醋艾葉飲片指紋圖譜共有模式的建立 運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”對10批醋艾葉飲片的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，以S－1號樣品色譜圖作為參照圖譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正、自動匹配，以中位數(shù)法，生成對照圖譜R，由匹配數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到共有峰共26個(gè)，通過峰面積的比較，選取峰面積較大且穩(wěn)定的圖譜共有峰，最后標(biāo)定了14個(gè)共有特征指紋峰，結(jié)果見圖2。

參比峰的選擇:異澤蘭黃素的色譜峰(13號色譜峰)在各批次樣品圖譜中分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定其為參照峰。

以異澤蘭黃素保留時(shí)間和峰面積為參照，對10批樣品中14個(gè)特征指紋峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果分別見表3、表4。

2.6.2 相似度評價(jià) 使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”，對10批醋艾葉指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果，10批次醋艾葉飲片與相應(yīng)對照圖譜的相似度在0.979～0.997 之間，均大于0.90，符合要求，結(jié)果見表5。

表3 10批醋艾葉共有特征峰相對保留時(shí)間

表4 十批醋艾葉共有特征峰相對峰面積

表5 與共有模式比較的醋艾葉相似度

2.7 醋艾葉、野艾醋炙品HPLC圖譜比較 取野艾醋炙品，照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照HPLC指紋圖譜條件進(jìn)行測定，將采集圖譜與醋艾葉對照圖譜比較，分析二者差別，主要色譜峰峰面積比較，結(jié)果見圖4和表6。

將野艾葉醋炙品HPLC圖譜與生成的對照圖譜R比較發(fā)現(xiàn)，野艾醋炙品HPLC圖譜與對照圖譜存在較大差異，野艾葉中37.354和41.941 min色譜峰峰面積明顯小于正品醋艾葉，46.571 min色譜峰在野艾醋炙品中未檢出，野艾醋炙品較正品醋艾葉多出A色譜峰。結(jié)果見圖4。將野艾葉與對照圖譜R峰面積比較，野艾葉醋炙品極性較大的成分較多，極性小的成分峰面積明顯小于正品醋艾葉。

圖4 醋艾葉對照圖譜R與野艾醋炙品HPLC圖譜比較(上為醋艾葉，下為野艾醋炙品)

表6 正品醋艾葉與野艾醋炙品比較結(jié)果

2.8 異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定 采用HPLC指紋圖譜條件，以外標(biāo)一點(diǎn)法測定不同產(chǎn)地醋艾葉中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量，結(jié)果見表7。

表7 不同批次醋艾葉異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定結(jié)果

由上表可見，10批醋艾葉之間含量存在一定差異，異澤蘭黃素含量在0.10% ～0.17%，棕矢車菊素含量在0.10%～0.22%，道地產(chǎn)區(qū)安徽及艾葉的主要產(chǎn)區(qū)三個(gè)產(chǎn)地的含量均較高。野艾葉醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量分別為0.04%、0.07%，明顯低于各批次醋艾葉。

3 討論

建立中藥指紋圖譜，色譜條件的優(yōu)化是關(guān)鍵。本研究通過色譜條件優(yōu)選，結(jié)果選擇乙腈－0.2%甲酸作為流動相，各峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，且基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析，因此采用乙腈－0.2%甲酸水作為流動相系統(tǒng);實(shí)驗(yàn)中比較了室溫(25℃)、30℃下的分離效果，結(jié)果表明柱溫對分離效果影響不大，因此柱溫選擇為室溫(25℃);通過比較210、230、254、280 和 330 nm 波長下的液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)330 nm條件下色譜峰面積較大，色譜峰分離度最好，色譜圖基線噪音較低，因此選擇330 nm為檢測波長。

采用研究確定的指紋圖譜色譜條件對10批不同產(chǎn)地醋艾葉進(jìn)行了指紋圖譜分析，將艾葉指紋圖譜評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)暫定為14個(gè)特征峰。通過測定，市售醋艾葉與生成的對照圖譜比較相似度良好，均大于0.90。不同產(chǎn)地醋艾葉指紋圖譜在相對保留時(shí)間上具有較高相似性，但在相對峰面積上又不完全一致，可能是由于生品艾葉生長環(huán)境不同，導(dǎo)致其醋炙品的質(zhì)量存在差異。采用HPLC色譜條件測定了10批醋艾葉中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量，結(jié)果異澤蘭黃素含量在0.10% ～0.17%，棕矢車菊素含量在0.10% ～0.22%，可作為指標(biāo)成分控制醋艾葉質(zhì)量。

通過野艾葉醋炙品HPLC圖譜與生成的醋艾葉對照圖譜R比較，野艾葉中色譜峰A為野艾特有色譜峰，14號色譜峰為10批艾葉共有峰，但野艾沒有。異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定結(jié)果可見，野艾葉醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量明顯低于各產(chǎn)地的醋艾葉，這些特征均可用于區(qū)別艾葉與野艾葉。

本研究首次建立了醋艾葉HPLC指紋圖譜及異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量測定方法，得到的色譜圖主要色譜峰分離度較好，基線平穩(wěn)，可為醋艾葉的全面質(zhì)量控制研究提供參考。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:83.

［2］陳宗良，張慧芳.艾葉，野艾及細(xì)艾葉的比較鑒別［J］.中藥材，1999，22(5):235 －237.

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