乳酸菌對DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道通透性影響

李 丹，鄭軍紅，李金敏，程秀芳，谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000)

腸黏膜通透性是指分子由非載體依賴擴(kuò)散的方式通過腸道上皮細(xì)胞層的過程，也是指某一特定物質(zhì)在腸黏膜表面通過非易化擴(kuò)散方式滲透的能力［1］。有研究［2，3］表明，腸黏膜通透性的改變可發(fā)生在腸道出現(xiàn)明顯的炎性改變前。腸道炎癥加重時，腸黏膜通透性則進(jìn)一步明顯增加。腸黏膜屏障是機(jī)體內(nèi)外聯(lián)系的重要界面，若在各種病理因素作用下腸黏膜受損則引起腸內(nèi)外多種炎性失調(diào)，引起腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加，腸道菌群失調(diào)［4］，尤其體現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎、感染性結(jié)腸炎及腸外等疾患，腸黏膜屏障的改善對這些疾病不僅有助于控制病情，提高療效，對危重疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸也有十分重要的意義。本研究選用該公司菌種保藏中心兩株乳酸桿菌(植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467)經(jīng)過嚴(yán)格篩選鑒定，并通過體外模擬胃腸環(huán)境抗性、體外抑菌能力等優(yōu)選菌株，最終確定為我們的實驗用菌。通過D－乳酸的測定，研究灌胃乳酸菌菌液對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)小鼠腸黏膜通透性的影響，為臨床應(yīng)用益生菌治療UC提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性昆明種小鼠60只，鼠齡6～7周，體重18～22 g，購于山東泰邦生物制品有限公司(許可證號:SCXK(魯)2009－0004);葡聚糖硫酸鈉購自MP Biomedicals公司;血D－乳酸試劑盒購于上海越研生物;菌株由本公司菌種保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 給小鼠5%DSS溶液自由飲用7d制備急性潰瘍性結(jié)腸炎模型［5］，造模前2 d進(jìn)行治療觀察。將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為4個組，正常對照組:自由采食飲水，無菌0.9%氯化鈉溶液灌胃;模型對照組:自由飲用5%DSS溶液，無菌0.9%氯化鈉溶液灌胃;乳酸菌(植物乳桿菌BLP)1組:自由飲用5%DSS溶液，并且每日菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃;乳酸菌(嗜酸乳桿菌 2 471)2組:自由飲用5%DSS溶液，并且菌液(5×109cfu·mL－1，15 mL·kg－1)灌胃，共 9 d。

1.2.2 受試物制備 將乳酸菌以2%接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，活菌計數(shù)。菌液4 000 r·min－1離心 10 min，離心上清液配制成濃度5 ×109cfu·mL－1。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 疾病活動指數(shù)評分 疾病活動指數(shù)評分［6］(disease activity index，DAI)，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3;正常大便為干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且黏肛門，大便隱血用聯(lián)苯胺法檢測。體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)分為5級，0分:無下降，1分:下降1% ～5%，2分:下降6% ～10%，3分:下降11% ～15%，4分:下降＞15%;大便性狀正常記為0分，半稀便記為2分，稀便記為4分;便血陰性為0分，隱血陽性為2分，肉眼血便為4分。

1.2.3.2 標(biāo)本的采集與處理 實驗第9天小鼠摘眼球取血，游離并取出結(jié)腸，迅速剖開，用預(yù)冷無菌生理鹽水沖洗干凈，于結(jié)腸處剪取1 cm長結(jié)腸，10%的中性甲醛固定液固定。石蠟包埋、切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)損傷評分(colon mucosal damage index，CMDI)，共分為5級，0 分:正常結(jié)腸黏膜，1分:隱窩腺體丟失1/3，2分:隱窩腺體丟失2/3，3分:隱窩腺體全部丟失，黏膜上皮完整，伴有輕度炎細(xì)胞浸潤，4分:黏膜上皮糜爛、破壞，伴有明顯炎細(xì)胞浸潤。

1.2.4 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，測定實驗結(jié)果用均數(shù)±s標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 疾病活動指數(shù)評分 正常對照組小鼠活動如常、毛發(fā)有光澤、飲食量正常、體重增加，DAI始終穩(wěn)定在低水平。模型對照組小鼠精神萎靡、毛發(fā)無光澤、飲食量減少，體重下降，并且出現(xiàn)稀便、血便，DAI呈逐漸上升趨勢，第9天達(dá)到最高值。制劑1、2組小鼠一般狀況隨治療給藥時間延長逐漸好轉(zhuǎn)，飲食量增加，血便減少或消失，DAI值均低于模型對照組，第7天DAI有明顯降低。由表1可見，模型組小鼠DAI值明顯高于正常對照組(P＜0.01)，乳酸菌1、2組與模型組比較降低(P＜0.01)，乳酸菌1、2組組間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 小鼠DAI值、CMDI值及血D－乳酸含量

2.2 組織學(xué)損傷評估

如圖1～4所示:正常對照組小鼠結(jié)腸可見黏膜上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊，隱窩正常;模型對照組可見炎癥主要累及黏膜、黏膜下層，上皮細(xì)胞缺失，浸潤的炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，黏膜下層增厚，水腫嚴(yán)重;乳酸菌1、2組小鼠結(jié)腸黏膜仍有少量炎細(xì)胞浸潤，腺體排列基本整齊，黏膜上皮細(xì)胞相對完整，有局部脫落，水腫較輕。

2.3 血D－乳酸含量 D－乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，腸道多種細(xì)菌均可產(chǎn)生。當(dāng)腸道發(fā)生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，細(xì)胞旁路徑增加而致腸黏膜通透性增加時，腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D－乳酸通過受損腸黏膜進(jìn)入血液中，而哺乳動物不具備將其快速降解的酶系統(tǒng)，通過檢測血清D－乳酸濃度，能有效判斷腸黏膜修復(fù)及評估腸道通透性改變情況。由表1可見，模型對照組D－乳酸水平顯著高于正常對照組，黏膜通透性明顯增加。乳酸菌1、2組與模型對照組比較是降低的，并且差異顯著。說明灌胃植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467菌液對小鼠腸黏膜通透性有改善。

3 討論

益生菌是對健康有益的活菌或活菌性膳食補(bǔ)充劑，利用益生菌的內(nèi)源性防御屏障和免疫性防御屏障作用拮抗致病菌來保護(hù)腸黏膜屏障，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞黏蛋白及sIgA的分泌，修復(fù)腸道黏膜屏障等作用，減少菌群易位和降低內(nèi)毒素濃度等。孫瑩杰［7］等研究發(fā)現(xiàn)益生菌可在一定程度上抑制炎性反應(yīng)，降低大鼠小腸黏膜通透性和細(xì)菌易位率，從而改善大鼠小腸黏膜屏障功能。王旭霞［8］等研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可通過降低腸道通透性，調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞因子，對大鼠結(jié)腸炎腸道黏膜發(fā)揮保護(hù)作用。White等［9］報道乳酸桿菌屬(LP299)在防止腸壁通透性的發(fā)展中也起到了重要的作用。

為了探討本實驗兩株乳酸菌對小鼠腸道黏膜通透性的改變，我們建立了DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型。造模過程中，小鼠出現(xiàn)體重下降、稀便、便血，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜充血、水腫、糜爛、出血及小潰瘍形成等類似人類UC的癥狀，病理組織學(xué)切片可見腸上皮細(xì)胞和腺體破壞，有炎癥細(xì)胞浸潤等，符合急性炎癥的組織病理學(xué)改變，說明所建立的小鼠急性UC模型是成功的。

腸黏膜通透性增加時腸道中細(xì)菌所產(chǎn)生的大量D－乳酸通過受損黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，因此D－乳酸水平可以反映腸道屏障功能變化［10］。通過對小鼠乳酸桿菌菌株發(fā)酵液灌胃處理，UC癥狀比模型對照組出現(xiàn)的晚且癥狀較輕，小鼠血D－乳酸濃度較模型對照組明顯降低，提示補(bǔ)充植物乳桿菌BLP、嗜酸乳桿菌2467可降低UC小鼠腸黏膜通透性，促進(jìn)腸黏膜屏障恢復(fù)。腸黏膜通透性的改善有助于控制病情，提高療效，對危重疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸也有十分重要的意義，本研究為乳酸菌預(yù)防保健、臨床治療改善腸壁通透性提供了理論支持。

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