濱州地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

齊鳳云 孫少麗（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 271018 山東省濱州第二高級(jí)技師學(xué)院）

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濱州地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

齊鳳云①②孫少麗②（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 271018 ②山東省濱州第二高級(jí)技師學(xué)院）

從濱州地區(qū)各養(yǎng)雞場(chǎng)的發(fā)病雞中分離出大腸桿菌，經(jīng)常規(guī)方法培養(yǎng)、純化、鏡檢及生理生化鑒定，分離出的18株雞致病性大腸桿菌12株分離株被鑒定出血清型，血清型主要有078、035、036、01、02、05、018。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：分離的大腸桿菌對(duì)氟苯尼考，丁胺卡那霉素，新霉素，慶大霉素敏感，對(duì)環(huán)丙沙星，強(qiáng)力霉素，諾氟沙星中度敏感，而對(duì)紅霉素，青霉素，鏈霉素產(chǎn)生了耐藥。

雞 大腸桿菌 分離鑒定 耐藥

大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌(Escherchia Coli)的某些血清型菌株所引起的一類傳染病的總稱。此試驗(yàn)是采集濱州地區(qū)雞的病料進(jìn)行分離鑒定和耐藥試驗(yàn)，從而為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶提供幫助，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病料來源于濱州地區(qū)各養(yǎng)殖場(chǎng)及養(yǎng)殖戶送檢的病、死雞，臨床剖檢有典型心包炎、肝周炎、氣囊炎或卵黃性腹膜炎，疑似為大腸桿菌病。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂均購(gòu)于上海伯奧生物科技有限公司。微量生化發(fā)酵管，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 藥敏試紙 紅霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、氟呱酸、丁胺卡那霉素、強(qiáng)力霉素、新霉素等10種藥敏試紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 小鼠購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；培養(yǎng)箱，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；高壓蒸汽滅菌器，山東新華醫(yī)療股份有限公司；光學(xué)顯微鏡、電子天平，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 血瓊脂平板的制備：按常規(guī)法(謝正腸等，1994)制備，加入5%的綿羊血，冷卻后置于4℃冰箱中備用。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板的制備：按常規(guī)法(謝正腸等，1994)制備，冷卻后于37。C溫箱培養(yǎng)16~24h，檢查無菌后置于4℃冰箱備用。營(yíng)養(yǎng)肉湯的制備：按常規(guī)法(謝正腸等，1994)制備，冷卻后于4℃冰箱中備用。

1.2.2 細(xì)菌分離鑒定 選擇疑似大腸桿菌病死雞的病料接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)過37℃培養(yǎng)16~24h，然后對(duì)可疑菌株再進(jìn)行操作。

1.2.3 染色鏡檢 按常規(guī)步驟進(jìn)行染色。

1.2.4 病原菌的分離純化及生化試驗(yàn) 取病料無菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)過37℃培養(yǎng)18~24h后，觀察結(jié)果。選取具有隆起、圓形、光滑、濕潤(rùn)、半透明的近無色的菌落，分別劃線接種于麥康凱瓊脂和伊紅美蘭瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18~24h，4℃保存?zhèn)溆?。分別作各種糖發(fā)酵試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、MR、V-P。

1.2.5 致病力測(cè)定 隨機(jī)抽取麥康凱上純培養(yǎng)的菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，取24h內(nèi)培養(yǎng)物作注射液，腹腔接種于健康1日齡小雞，每只小雞注射0.2ml，每株菌注射2只小雞，并作對(duì)照。24h內(nèi)發(fā)病并死亡者，判定為高致病力菌株。24~48h內(nèi)發(fā)病并死亡者，判定為中致病力菌株記錄死亡數(shù)，48h后死亡者判定為低致病力菌株。然后，從死亡雞的心、肝中回收接種菌。

1.2.6 分離菌的血清型鑒定 （1）抗原的制備。將純培養(yǎng)的被檢驗(yàn)菌株接種于普通瓊脂斜面小管和普通肉湯小瓶培養(yǎng)基(50ml)，于37℃培養(yǎng)24h，期間震蕩肉湯數(shù)次。用0.5%石炭酸生理鹽水洗下普通瓊脂斜面小管培養(yǎng)物，然后以2000r/min離心5min，取上懸液以2000r/min離心10min，取沉淀物制成濃稠菌懸液，放于小圓底試管中，再與普通肉湯小瓶培養(yǎng)物一起于121℃高壓2h，4℃保存?zhèn)溆?。?）血清的稀釋。多價(jià)血清的配制：將多種大腸埃希氏菌因子凍干血清混合溶解于0.5%石炭酸生理鹽水10ml，裝入小瓶，蓋緊，4℃冰箱保存。單因子血清的配制：將每種大腸埃希氏菌因子血清溶解于5ml 0.5%石炭酸生理鹽水中，置于小瓶，蓋緊，置4℃冰箱保存。（3）玻板凝集反應(yīng)。取試管己制成的高壓抗原，先與大腸埃希氏菌多價(jià)血清進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，然后再與大腸埃希氏菌單因子血清進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)。把高壓抗原和血清各取一鉑金耳置玻板上混勻，0.5min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為“陽(yáng)性”。同時(shí)以高壓抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。最終結(jié)果判定：以“++”作為被檢抗原的效價(jià)終點(diǎn)。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上，將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后，觀察效果。判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏紙片的種類及判定標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑 （mm）

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 細(xì)菌分離 37℃培養(yǎng)24h后，普通肉湯呈均勻混濁，試管底部有淡白色粘稠沉淀，輕輕搖晃呈云霧狀散開，并有臭糞味。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，為圓形微凸起，表面光滑濕潤(rùn)，中等大小，淺灰色半透明菌落，在血液瓊脂上出現(xiàn)邊緣整齊，菌落較大，并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小表面光滑濕潤(rùn)的粉紅色菌落。在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。

2.1.2 細(xì)菌鑒定 從濱州不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)的20多個(gè)雞場(chǎng)病例中，共分離到18株疑似大腸桿菌。病死雞心、肝組織及培養(yǎng)物涂片染色鏡檢可見大多數(shù)分散排列，兩端鈍圓，偶爾有2~3個(gè)連在一起，兩端濃染的革蘭氏陰性短桿菌。分離到的18株菌，各菌均對(duì)大多數(shù)糖類(葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，緩慢發(fā)酵蔗糖)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，MR試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，產(chǎn)生靛基質(zhì)，三糖鐵底層產(chǎn)酸，尿素酶試驗(yàn)陰性。見表2。

表2 18株分離菌的生化鑒定結(jié)果

2.2.3 分離菌株的致病性結(jié)果 根據(jù)雛雞及小鼠接種大腸桿菌后出現(xiàn)的癥狀、剖檢變化的不同及死亡時(shí)間，可以將所分離的大腸桿菌分為3組。強(qiáng)毒組，有10株接種后24h內(nèi)小鼠及雛雞全部死亡；剖檢呈急性敗血癥變化，死亡雛雞在剖檢時(shí)，表現(xiàn)為纖維素性心包炎，心包積液，心包膜心外膜有大量纖維蛋白沉著；氣囊炎，氣囊表面及氣囊中有量黃白色干酪樣滲出物；脾臟腫大、出血肝周炎、肝臟表面被一層薄膜狀的纖維素性滲出物班蓋。中毒組，有5株接種后24h內(nèi)小鼠及雛雞各死亡2/3，雛雞及小鼠均出現(xiàn)腹瀉，精神沉郁等癥狀。弱毒組，有3株接種后24h內(nèi)1/3的小鼠及雛雞致死，雛雞、小鼠出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉等癥狀。從死亡雞及小鼠肝臟、心血及脾臟回收細(xì)菌的染色、生化特性與接種菌一致。

2.2.4 血清型鑒定結(jié)果

表3 18株分離菌血清型鑒定結(jié)果

從表3中可以看到：18株分離的菌株中，定型菌株有12株，6株未定型。血清型主要有078、035、036、01、02、05、018。其中078共有4株占33.3%，035共有3株占25%為濱州的優(yōu)勢(shì)血清型。

2.2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可以看出：分離的大腸桿菌對(duì)氟苯尼考，丁胺卡那霉素，新霉素，慶大霉素不同方位高度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星，強(qiáng)力霉素，諾氟沙星中度敏感，而對(duì)紅霉素，青霉素，鏈霉素產(chǎn)生了耐藥。

表4 濱州地區(qū)不同方位分離菌平均抑菌圈直徑 (mm)

3 討論

3.1 病原的特點(diǎn)

試驗(yàn)結(jié)果表明：從8個(gè)不同鎮(zhèn)20個(gè)雞場(chǎng)分離到的18株菌對(duì)大多數(shù)糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)陰性，產(chǎn)生靛基質(zhì)，MR試驗(yàn)陽(yáng)性，三糖鐵底層產(chǎn)酸，尿素酶試驗(yàn)陰性。這都符合大腸桿菌的特征；分離菌株接種雛雞均具有致病性。其中55.56%的分離菌株具有高致病性，27.78%的分離菌株具有中致病性，16.67%的分離菌株具有低致病性。由此可見，雞大腸桿菌病給生產(chǎn)帶來巨大的損失。

3.2 病原的來源

致病型大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型在我國(guó)不同地區(qū)種類差異很大，本次試驗(yàn)分離的078、035是濱州地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型。同一地區(qū)，血清型差異也很大，這可能與雞苗的來源不同有關(guān)系。雞苗的大流通可能帶來了大腸桿菌的傳播。

3.3 病原變異的原因

環(huán)境中大腸桿菌耐藥性菌株越來越多，這主要是與以下幾種因素有關(guān)：首先用藥過程中劑量、選藥、療程不當(dāng)；其次是嚴(yán)重濫用抗生素?，F(xiàn)在幾乎所有的養(yǎng)雞戶都在濫用抗菌素的現(xiàn)象。臨床中，抗菌素也能造成雞病，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成一定危害。

3.4 影響藥敏結(jié)果的因素

（1）培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時(shí)，厚度合適約5~6nm，不可太薄，一般直徑的培養(yǎng)皿90nm，傾注18~20ml培養(yǎng)基為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能使氨基糖營(yíng)類的抗菌活性降低，胸腺嚓陡核普和對(duì)氨苯甲酸能拮抗磺胺藥和TMP的活性。（2）細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)該穩(wěn)定，如果太多，抑菌圈就會(huì)變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。（3）藥物濃度：抑菌試驗(yàn)的結(jié)果受藥物的濃度和總量直接影響，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。（4）培養(yǎng)時(shí)間：一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃ 9~20h，有些抗菌藥擴(kuò)散慢。如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置5℃冰箱內(nèi)2~5h，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后培養(yǎng)在37℃溫箱中，可以延長(zhǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而得到較大的抑菌圈。

3.5 防治的藥物

臨床用氟苯尼考、丁胺卡那霉素、慶大霉素、硫酸新霉素可以達(dá)到比較好的效果。但隨著耐藥菌株的日益增多，抗生素對(duì)大腸桿菌的防治效果越來越差，而且現(xiàn)在藥物用量也越來越大，最后會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，從而影響家禽產(chǎn)品質(zhì)量，威脅人類的健康。因此，加強(qiáng)生物安全措施，合理使用疫苗，選擇有效的抗生素，才是控制大腸桿菌最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

4 結(jié)論

（1）從濱州地區(qū)分離到雞致病性大腸桿菌18株菌株，通過O因子血清學(xué)鑒定，定型菌株有12株，6株未定型。血清型主要有078、035、036、01、02、05、018。其中078共有4株占33.3%，035共有3株占25%為濱州地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型。（2）藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的大腸桿菌對(duì)氟苯尼考，丁胺卡那霉素，新霉素，慶大霉素敏感，對(duì)環(huán)丙沙星，強(qiáng)力霉素，諾氟沙星中度敏感，而對(duì)紅霉素，青霉素，鏈霉素產(chǎn)生了耐藥。（3）致病性試驗(yàn)中，高致病性菌株有10株，中度致病菌株有5株，低致病性菌株有3株，分別占試驗(yàn)菌株總數(shù)的55.6%、27.8%、16.7%。

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（2012–02–23）

S858.31

A

1007-1733(2012)05-0004-03