不同對(duì)蝦中多酚氧化酶的提取比較及在蝦體的分布研究

吳亮亮，楊會(huì)成，廖妙飛，鐘明杰，郝云彬，鄭 斌，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316000;2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316100)

不同對(duì)蝦中多酚氧化酶的提取比較及在蝦體的分布研究

吳亮亮1，楊會(huì)成2，廖妙飛2，鐘明杰2，郝云彬2，鄭 斌2，*

（1.浙江海洋學(xué)院食品醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316000;2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316100)

用丙酮法和勻漿浸提法分別對(duì)南美白對(duì)蝦和中華管鞭蝦進(jìn)行多酚氧化酶的提取，結(jié)果表明，在同樣的提取條件下，中華管鞭蝦的酶活大于南美白對(duì)蝦，勻漿浸提法提取的酶活比丙酮法高1.5倍;同時(shí)對(duì)中華管鞭蝦的提取條件料液比、緩沖液pH、浸提時(shí)間、水浴溫度做了研究，通過正交實(shí)驗(yàn)得到當(dāng)料液比1∶4，緩沖液pH8，浸提時(shí)間3h，水浴溫度45℃條件下提取的酶具有最大的活性;進(jìn)一步研究中華管鞭蝦的多酚氧化酶在蝦體中的分布情況，得出蝦頭部位多酚氧化酶含量較高，蝦尾和蝦身含量較低。

對(duì)蝦，多酚氧化酶，酶活力，酶分布

酚氧化酶（Phenoloxidase，PO)，又稱多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO)或酪氨酸酶（Tyrosinase)[1]。它分布很廣，在微生物、植物、動(dòng)物和人體中都有存在。研究發(fā)現(xiàn)，該酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶[2]。而蝦褐變的主要原因是多酚氧化酶在有氧條件下催化體內(nèi)的L-多巴和酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴色素和其他發(fā)色基團(tuán)，進(jìn)一步氧化形成黑色素物質(zhì)，因此對(duì)PPO的研究日益引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。我國(guó)是蝦類養(yǎng)殖和捕撈大國(guó)，僅2010年對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量就已達(dá)116萬t，約占世界對(duì)蝦產(chǎn)量的43.7%，仍有增長(zhǎng)的趨勢(shì)。2008年我國(guó)出口到美國(guó)的對(duì)蝦數(shù)量已占據(jù)第四位，但由于蝦類黑變嚴(yán)重以及違法添加劑的過量使用，引起蝦體品質(zhì)下降，有害殘留物超標(biāo)，導(dǎo)致其價(jià)格在亞洲的對(duì)蝦輸出國(guó)中墊底，僅為4766美元/t，比美國(guó)的進(jìn)口對(duì)蝦平均價(jià)格低31%，出口日本的對(duì)蝦價(jià)格也比市場(chǎng)平均價(jià)格低27%。因此，蝦類的黑變抑制和鮮度維持，直接關(guān)系到我國(guó)的出口創(chuàng)匯以及人們的食用安全。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，蝦類的黑變與自身所攜帶的多酚氧化酶密切相關(guān)，因此，研究海水蝦類PPO分布規(guī)律以及黑變機(jī)理，對(duì)于延長(zhǎng)海水甲殼類貨架期，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)具有重要意義。本文以南美白對(duì)蝦和中華管鞭蝦為原料，研究其PPO的提取方法和最佳提取條件，以及PPO在中華管鞭蝦體的分布情況，為進(jìn)一步研究蝦類的褐變?cè)硪约昂肿兊挠行б种铺峁┮罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的南美白對(duì)蝦、中華管鞭蝦 購(gòu)自舟山北門菜場(chǎng)，大小均勻，帶回實(shí)驗(yàn)室存于-18℃冰箱中;L-3-（3，4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸（L-DOPA) 上海安譜科學(xué)儀器公司;三（羥甲基)氨基甲烷、丙酮（分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2102C型紫外可見分光光度計(jì) 上海儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海分析儀器廠;CR21G冷凍離心機(jī) 日本日立。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法的選擇 丙酮法[3-4]：稱取半解凍后的蝦（帶頭)20g，加入80mL預(yù)冷至-18℃的丙酮（W/V= 1∶4)，用高速組織勻漿機(jī)打碎，真空抽濾（0.5MPa)，然后用冰丙酮反復(fù)沖洗殘?jiān)?，冷凍干燥得丙酮粉。?g丙酮粉加入500mL pH8.0的預(yù)冷Tris-HCl緩沖液，磁力攪拌20min，然后在轉(zhuǎn)速12000r/min，溫度4℃條件下，冷凍離心10min，所得上清液即為粗酶液。樣品加入2.5mL的L-3-（3，4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸（L-DOPA)，45℃水浴10min，在490nm處比色測(cè)定吸光值。

勻漿浸提法[4]：稱取半解凍后的蝦（帶頭)20g，與80mL pH8.0的Tris-HCl（W/V=1∶4)混合后，4℃下破碎成肉糜，靜置3h，然后于4℃，12000r/min條件下，冷凍離心10min，后取其上清液，作為粗酶液。樣品加入2.5mL的L-DOPA，45℃水浴10min，在490nm處比色測(cè)定吸光值。

1.2.2 提取條件的篩選 按照上述1.2.1中最佳提取方法，選擇料液比、pH、浸提時(shí)間、水浴溫度4個(gè)因素作為優(yōu)化提取條件的效應(yīng)因子，并逐一研究。

1.2.2.1 料液比對(duì)提取酶活的影響 固定其他條件，分別加入pH8.0的預(yù)冷Tris-HCl緩沖液20、40、60、80、100mL，最后比色測(cè)定吸光值。

1.2.2.2 緩沖液pH對(duì)提取酶活的影響 固定其他條件，分別加入pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的預(yù)冷Tris-HCl緩沖液80mL，最后比色測(cè)定吸光值。

1.2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)提取酶活的影響 固定其他條件，分別靜置浸提2、3、4、5、6h，最后比色測(cè)定吸光值。

1.2.2.4 水浴溫度對(duì)提取的影響 固定其他條件，分別在25、35、45、55、65℃水浴，最后比色測(cè)定吸光值。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 采取4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究料液比、緩沖液pH、浸提時(shí)間、水浴溫度4個(gè)變量對(duì)中華管鞭蝦的PPO提取效果的影響，并依次設(shè)定A、B、C、D，按正交表L9（34)安排實(shí)驗(yàn)，各因素正交水平如表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor list of orthogonal experiment

1.2.4 PPO在中華管鞭蝦體分布研究 分別取中華管鞭蝦的蝦頭、蝦身、蝦尾各20g左右，按照1.2.1中勻漿浸提法，比色測(cè)定不同部位的酶的酶活[5]。

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定[6-7]：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100mL，制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL，制成考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)準(zhǔn)確吸取1.0mL樣品溶液于一支干燥潔凈的試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5mL，搖勻，室溫靜置2min，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)管為對(duì)照，用分光光度計(jì)在595nm處比色，記錄吸光值，計(jì)算結(jié)果。

1.2.5 酶活 每分鐘吸光值增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位（A490×103/min)[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPO提取方法的選擇

表2 兩種提取方法酶活的對(duì)比Table 2 Contrast of enzyme activity on two extraction methods

通過表2可以看出，采用勻漿浸提法提取的兩種蝦中PPO的酶活都比丙酮法提取的結(jié)果高，其中勻漿浸提中華管鞭蝦和南美白對(duì)蝦得到的PPO的酶活分別是丙酮法的1.5倍和1.4倍。并且無論采用哪種方法提取PPO，中華管鞭蝦的酶的酶活均高于南美白對(duì)蝦。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用中華管鞭蝦做PPO的提取對(duì)象。

2.2 勻漿浸提法最佳提取條件的選擇

2.2.1 料液比對(duì)提取PPO活性的影響 由圖1可以看出，酶的活性隨著緩沖液體積的增大而增大，在緩沖液體積為80mL，即料液比1∶4時(shí)達(dá)到最大值，原因可能是緩沖液體積較少時(shí)，不能夠與樣品充分接觸，提取的酶較少;當(dāng)緩沖液超過80mL時(shí)，緩沖液過多，稀釋了酶液，從而導(dǎo)致酶的濃度降低。

圖1 料液比對(duì)提取PPO的影響Fig.1 The effect of different ratio of sample weight to the solvent volume on extraction

2.2.2 緩沖液pH對(duì)提取PPO活性的影響 從圖2中可以看出，當(dāng)緩沖液pH為8時(shí)，提取的PPO的酶活最大，此時(shí)酶活為36.9A490×103/min;當(dāng)緩沖液pH高于8或者低于8時(shí)，提取的PPO酶活都會(huì)降低。原因可能是PPO催化底物反應(yīng)需要適宜的pH，高于或低于此pH都會(huì)影響PPO的活性。

圖2 緩沖液pH對(duì)提取的影響Fig.2 The effect of different pH on extraction

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)提取PPO活性的影響 由圖3可以看出，總趨勢(shì)是酶的活性隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，在2～4h區(qū)間內(nèi)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性增大較快，這段時(shí)間可能是勻漿后的原料蝦中的PPO濃度比緩沖液中的高，所以能不斷地溶于緩沖液中，從而使浸提效率不斷升高;浸提4h之后，酶的活性略有下降，一方面可能是緩沖液提取的PPO速率達(dá)到一個(gè)平衡，另一方面可能是由于環(huán)境等其他原因?qū)е翽PO分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而使整體的酶的活性略有降低。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)提取的影響Fig.3 The effect of different extraction time on extraction

2.2.4 溫度對(duì)提取PPO活性的影響 從圖4可以看出，隨著溫度的升高，酶活先升高后降低，在45℃酶活達(dá)到最大34.5A490×103/min，當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，酶的活性很快降低。當(dāng)溫度在25～45℃范圍內(nèi)，溫度較低，酶的活性不高;在達(dá)到45℃時(shí)，接近于酶的最適溫度，發(fā)揮最大活性;當(dāng)超過45℃時(shí)，酶活會(huì)降低;當(dāng)溫度達(dá)到65℃，酶由于高溫導(dǎo)致失活，活性迅速降低。

圖4 溫度對(duì)提取的影響Fig.4 The effect of different temperatures on extraction

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3PPO提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of the orthogonal test

由表3可知，4個(gè)因素對(duì)PPO提取的影響順序是B> A>D>C，由K值和極差值R可知，在料液比1∶4、緩沖液pH8.0、浸提3h、水浴溫度45℃條件下，提取的酶活最大，重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)定此條件下的酶活為35.80、38.20、37.70A490×103/min，平均值為37.23A490×103/min。這與單因素實(shí)驗(yàn)稍有不同的是浸提時(shí)間，由于浸提時(shí)間極差值最小，對(duì)PPO的提取影響較小，而且浸提時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致酶暴露于細(xì)胞外時(shí)間過長(zhǎng)，活性有所降低，所以考慮實(shí)驗(yàn)的各種因素，浸提時(shí)間可定為3h。

2.4 PPO在中華管鞭蝦中的分布

2.4.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Protein standard curve

2.4.2 PPO在中華管鞭蝦體分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從表4可以看出，從蝦頭提取的PPO的酶活最大，酶的比活力也最大，可以初步得出PPO在蝦頭的含量最大，蝦身和蝦尾提取的PPO的酶活要低一些，且蝦尾的PPO的酶活和比活力都高于蝦身。而實(shí)際生產(chǎn)中，蝦死亡后最開始黑變的部位是頭部，接著肌肉變軟，各種微生物入侵蝦體，在多種酶和微生物的作用下蝦體開始腐敗，隨后尾部逐漸出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，殼肉逐漸脫離，最后是蝦身變黑[9-10]。這與實(shí)驗(yàn)所得出的PPO在整蝦的分布基本相符合，可以初步判斷PPO主要集中在頭尾，蝦身部分比較少，活性較低。因此，今后對(duì)PPO的研究實(shí)驗(yàn)將更多地集中在蝦頭部分。

表4 PPO在中華管鞭蝦體分布結(jié)果Table 4 The distribution of PPO in solenocera crassicornis

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)南美白對(duì)蝦和中華管鞭蝦PPO的提取方法的研究，可以看出用勻漿浸提法提取的酶活較高，丙酮提取法對(duì)PPO的分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用。

3.2 中華管鞭蝦勻漿浸提法最佳條件為：料液比1∶4，緩沖液pH8.0，浸提時(shí)間3h，水浴溫度45℃，此條件下PPO的酶活最大為37.23A490×103/min。

3.3 中華管鞭蝦PPO主要分布于蝦頭，提取的酶活和比活力最大，其次是蝦尾，蝦身酶活和比活力最低。對(duì)蝦類黑變主效應(yīng)因子多酚氧化酶提取及分布規(guī)律的研究，將為后續(xù)保鮮劑的開發(fā)以及實(shí)際生產(chǎn)過程中的防護(hù)起到積極作用。

[1]MW Johansson，K Soderhall.Cellular immunity in crustaceans and the pro PO system[J].Parasitology Today，1989（5)：171-176.

[2]Soderhall K，Cerenius L.Role of the prophenoloxidaseactivating system in invertebrate immunity[J].Current Opinion in Immunology，1998（10)：23-28.

[3]余華，周洪波，何龍海，等.茄子多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究[J].食品科學(xué)，2003（12)：44-46.

[4]陳麗嬌，鄭明峰，李怡賓.南美白對(duì)蝦多酚氧化酶的生化特性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，3（9)：377-380.

[5]趙嬌，趙福昌.對(duì)蝦中酚酶活性部位及穩(wěn)定性分析[J].職業(yè)與健康，2000，12（12)：37-38.

[6]Alexander R R，Grififiths J M.Basic bochernical methods[J]. J Blod Chem，1985：14-16，48-49.

[7]Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)ovrr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Blod Chem，1951：265-275.

[8]樊延俊，汪小鋒.中國(guó)對(duì)蝦酚氧化酶的分離純化及其部分生物化學(xué)性質(zhì)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2002，34（5)：589-594.

[9]陳佳榮，王以農(nóng).若干水產(chǎn)品變化鮮度的研究[J].福建水產(chǎn)，1993（4)：39-44.

[10]須山三千三，鴻巢章二.水產(chǎn)食品學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1992：69-70.

Study on extraction of polyphenoloxidase and enzyme distribution on different shrimps

WU Liang-liang1，YANG Hui-cheng2，LIAO Miao-fei2，ZHONG Ming-jie2，HAO Yun-bin2，ZHENG Bin2，*
（1.School of Food and Pharmacy&Medical School，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China;2.Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316100，China)

Extraction of polyphenoloxidase from penaeus vannamei and solenocera crassicornis were studied using two methods，acetone method and homogenate method.It was found that the activity of polyphenoloxidase in solenocera crassicornis was higher than that in penaeus vannamei under the same extraction condition.The enzyme activity extracted by homogenate method was 1.5 times higher than acetone method.Orthogonal test result showed that the optimal extraction conditions were as follows：Solid to solvent ratio 1∶4，pH8.0，extraction time 3h，extraction temperature 45℃.And the distributed rule of polyphenoloxidase in solenocera crassicornis was studied.The results indicated that polyphenoloxidase activity was higher in the part of prawn’s head than that in the part of body and trail.

shrimp;polyphenoloxidase;enzyme activity;enzyme distribution

TS254.1

A

1002-0306（2012)07-0055-04

2011－05－02 *通訊聯(lián)系人

吳亮亮（1986-)，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與應(yīng)用。

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2010DFB33030);浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011R09031);浙江省優(yōu)先主題重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2009C12008);“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2012BAD29B06)。