α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷作用機(jī)理探究

黃金蓮，黃秀娟，鐘振聲

（華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州 510640)

α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷作用機(jī)理探究

黃金蓮，黃秀娟，鐘振聲*

（華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州 510640)

通過用高效液相色譜（HPLC)全程跟蹤轉(zhuǎn)苷反應(yīng)過程的方法，對α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶將麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫慃溠刻堑拿复俜磻?yīng)作用機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化過程中α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶先把麥芽糖的α-1，4糖苷鍵打斷，分解為兩個葡萄糖單元，然后再通過α-1，6糖苷鍵連接的方式重新鍵合，完成從麥芽糖到異麥芽糖的異構(gòu)化過程。而由麥芽糖生成異麥芽糖的整個轉(zhuǎn)苷過程是在分子內(nèi)進(jìn)行的。與此同時，由麥芽糖分解出來的部分葡萄糖單元通過分子間作用的方式與麥芽糖或異麥芽糖發(fā)生反應(yīng)，生成潘糖或者異麥芽三糖。

α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，異麥芽糖，催化，機(jī)理，轉(zhuǎn)苷

α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶（α-transglucosidase E.C. 2.4.1.24)又稱α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase E.C.3.2.1.20)，是工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖（IMO)的關(guān)鍵酶之一，在國內(nèi)外食品工業(yè)界備受重視。它廣泛分布在自然界中，種類繁多，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有生物體內(nèi)，在人類的糖原降解及動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能[1]。我國對α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的研究主要集中在菌種的篩選和應(yīng)用以及體外抑制等方面[2-8]，對其性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)尤其是催化作用機(jī)理等方面的報道較少[9-10]。目前國內(nèi)食品工業(yè)生產(chǎn)IMO所用的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶主要來自進(jìn)口，而且主要用于生產(chǎn)，并未對其進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。作者對日本天野制藥公司生產(chǎn)的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶對麥芽糖的轉(zhuǎn)苷作用機(jī)理進(jìn)行了探究，初步確定其催化機(jī)理為分子內(nèi)轉(zhuǎn)化機(jī)理，為科學(xué)用酶提供理論依據(jù)。麥芽糖是由兩個葡萄糖分子通過α-1，4糖苷鍵連接而成的雙糖，異麥芽糖是由兩個葡萄糖分子通過α-1，6糖苷鍵連接而成的雙糖。有文獻(xiàn)[11]報道α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的催化過程分兩步完成，第一步α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的活性中心與底物結(jié)合;第二步進(jìn)行催化反應(yīng)生成產(chǎn)物。據(jù)此加上轉(zhuǎn)苷過程中葡萄糖的含量增多的事實(shí)，作者推斷，轉(zhuǎn)化過程中在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)作用下，麥芽糖分子中α-1，4糖苷鍵發(fā)生斷裂，水解成兩分子葡萄糖;然后兩分子葡萄糖通過α-1，6糖苷鍵重新組合，生成異麥芽糖。結(jié)構(gòu)見圖1。問題是，上述分子重組有可能是通過分子內(nèi)作用的方式發(fā)生，也有可能通過分子間作用的方式來完成。兩種不同的作用機(jī)理會導(dǎo)致不同的反應(yīng)結(jié)果，反應(yīng)產(chǎn)物存在差異?？刂品磻?yīng)的手段也有所不同。分子間重組機(jī)理，示意圖見圖2。分子內(nèi)重組機(jī)理，示意圖見圖3。如果是分子間重組機(jī)理，只要體系內(nèi)存在葡萄糖分子，在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促作用下都能夠生成異麥芽糖，達(dá)到反應(yīng)平衡時，剩余的葡萄糖比較少，而且應(yīng)該保持一個恒定值，不隨時間延長而變化。如果是分子內(nèi)重組機(jī)理，在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促作用下麥芽糖生成異麥芽糖的過程不受反應(yīng)體系內(nèi)其他糖存在的影響，例如體系內(nèi)原來存在的葡萄糖分子不會轉(zhuǎn)變?yōu)楫慃溠刻?。反?yīng)過程中葡萄糖的含量會呈現(xiàn)出先升高后下降的過程。本文將通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，討論上述兩種過程的可能性，并確定轉(zhuǎn)苷過程到底是分子內(nèi)還是分子間過程。

圖1 麥芽糖和異麥芽糖的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of maltose and isomaltose

圖2 分子間過程示意圖Fig.2 Process of intermolecular

圖3 分子內(nèi)過程示意圖Fig.3 Process of intramolecular

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶 日本天野制藥公司中國上海代理商;葡萄糖、麥芽糖 上海伯奧生物科技有限公司。

SHZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;高效液相色譜儀Agilent1100和waters1525。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥芽糖轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn) 分別將分析純的葡萄糖和生化試劑的麥芽糖加蒸餾水調(diào)配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的糖漿，調(diào)合適的pH，分別加入相當(dāng)于糖干物質(zhì)質(zhì)量5‰的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，在（58±1)℃的溫度下用振蕩器恒溫振蕩反應(yīng)預(yù)定的時間。

1.2.2 糖液成分分析 高效液相色譜法：色譜柱Ultimate Column Ultimate XB-NH2，5μm，4.6×250mm;流動相乙腈∶水=70∶ 30;流速1mL/min;柱溫35℃，柱壓8.27×106Pa左右，進(jìn)樣量20μL;檢測器溫度35℃。用標(biāo)準(zhǔn)樣品確定各色譜峰的歸屬，用峰面積歸一化計(jì)算各成分的相對比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽糖轉(zhuǎn)苷過程單雙糖成分的變化

以麥芽糖為起始物，用高效液相色譜（HPLC)全程跟蹤α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶將麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫慃溠刻堑霓D(zhuǎn)苷反應(yīng)過程，譜圖見圖4～圖6，數(shù)據(jù)列于圖7和表1。

可以明顯地觀察到體系中葡萄糖的變化。隨著反應(yīng)進(jìn)程，產(chǎn)生了葡萄糖，并且比例大幅度上升，由7.15%最高升至56.36%，而與此同時麥芽糖逐漸減少，異麥芽糖生成并且比例逐漸增加至某個平衡值。此結(jié)果預(yù)示著麥芽糖的轉(zhuǎn)苷過程有一個先水解為葡萄糖的過程。

圖4 起始麥芽糖圖譜Fig.4 HPLC of initial maltose

圖5 麥芽糖轉(zhuǎn)苷16h液相圖譜Fig.5 HPLC of 16th hour’s glycoside transferred maltose

圖6 麥芽糖轉(zhuǎn)苷32h液相譜圖Fig.6 HPLC of 32th hour’s glycoside transferred maltose

圖7 轉(zhuǎn)苷過程中單糖和二糖含量變化Fig.7 Content of monosaccharide and disaccharide in the transferring process

表1 麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)楫慃溠刻沁^程的糖分變化情況（%)Table 1 Sugar contents during maltose changed into isomaltose（%)

2.2 單純葡萄糖轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用分析純葡萄糖作為起始物，加入α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶進(jìn)行反應(yīng)，用高效液相色譜（HPLC)全程跟蹤糖分的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 純葡萄糖轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of pure glycosides glucose-transferred

盡管反應(yīng)時間延長到40h，體系中葡萄糖和異麥芽糖的比例變化不超過3%。也就是說，α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶不能把處于游離狀態(tài)的葡萄糖通過糖苷鍵連接成為雙糖。

由此可以合理地推測，在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)作用下，麥芽糖分子中α-1，4糖苷鍵發(fā)生斷裂，再重組為α-1，6糖苷鍵連接的異麥芽糖分子[12]，反應(yīng)過程中雖然先水解產(chǎn)生葡萄糖，但所產(chǎn)生的葡萄糖并非處于游離狀態(tài)，而是局限在很近的距離，彼此之間存在某種范德華作用力互相牽制。也就是說，所產(chǎn)生的葡萄糖不是一種中間體，而只是處于過渡狀態(tài)，單糖分子在分子內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，甚至有可能是α-1，4糖苷鍵斷裂與α-1，6糖苷鍵生成是同步進(jìn)行的。轉(zhuǎn)苷過程應(yīng)該是在分子內(nèi)發(fā)生的，遵從分子內(nèi)反應(yīng)機(jī)理。

相反，如果轉(zhuǎn)苷過程是分子間反應(yīng)機(jī)理，由麥芽糖水解出來的葡萄糖超出了分子的距離，處于游離狀態(tài)，那么用外加的葡萄糖也應(yīng)該能夠在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)作用下生成異麥芽糖。實(shí)驗(yàn)事實(shí)是相反的，所以分子間反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該不成立。

2.3 麥芽糖轉(zhuǎn)苷過程三糖含量的變化

在上述由麥芽糖作為起始物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中觀察到，除了生成異麥芽糖以外，還有數(shù)量不少的三糖，包括潘糖和異麥芽三糖生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 轉(zhuǎn)苷過程中二糖和三糖含量變化Fig.8 Content of disaccharide and trisaccharide in the transferring process

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：轉(zhuǎn)苷過程中潘糖的含量在轉(zhuǎn)苷開始時迅速升至很高，比例達(dá)到27.91%，隨著轉(zhuǎn)苷不斷進(jìn)行，比例逐步減少，16h后比例趨向平衡。轉(zhuǎn)苷開始時異麥芽三糖的比例急劇增加，8h之后比例變化不規(guī)則，大致趨向平衡。

上述結(jié)果表明，α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)并不是一個選擇性很高的專屬反應(yīng)[12]。麥芽糖轉(zhuǎn)苷過程水解出的葡萄糖在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的促進(jìn)下也可以與麥芽糖自身發(fā)生作用，通過α-1，6糖苷鍵生成潘糖和異麥芽三糖。其過程如圖9、圖10所示。

圖9 潘糖生成過程示意圖Fig.9 The generation of panose

圖10 異麥芽三糖生成過程示意圖Fig.10 The generation of isomaltotriose

麥芽糖與葡萄糖結(jié)合形成三糖的過程是分子內(nèi)反應(yīng)還是分子間反應(yīng)，其機(jī)理由下文實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷。

2.4 葡萄糖與麥芽糖混合物轉(zhuǎn)苷結(jié)果分析

按葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%的比例與麥芽糖混合作為起始物，反應(yīng)28h，同等條件下與純麥芽糖做起始物對比，觀察在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)作用下生成雙糖、三糖的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 葡萄糖與麥芽糖混合轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)結(jié)果（%)Table 3 Results of maltose glucose-transferred with glucose（%)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：盡管作為起始原料的混合糖中葡萄糖的含量大幅度發(fā)生變化，但是轉(zhuǎn)苷后產(chǎn)物中麥芽糖、異麥芽糖的比例并沒有明顯變化，印證了上文“轉(zhuǎn)苷過程應(yīng)該是在分子內(nèi)發(fā)生的，遵從分子內(nèi)反應(yīng)機(jī)理”的推論。同時，轉(zhuǎn)苷后產(chǎn)物中潘糖、異麥芽三糖的含量差別很小，這點(diǎn)在加入葡萄糖多時表現(xiàn)得尤為明顯，說明外加葡萄糖并不能提高轉(zhuǎn)苷效率，而與二糖結(jié)合產(chǎn)生三糖的單糖也是轉(zhuǎn)苷過程中產(chǎn)生的特殊狀態(tài)的單糖。

3 結(jié)論

α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶作用于麥芽糖的轉(zhuǎn)苷過程是在分子內(nèi)發(fā)生的，遵從分子內(nèi)反應(yīng)機(jī)理。在α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)作用下，麥芽糖分子中α-1，4糖苷鍵發(fā)生斷裂，再重組為α-1，6糖苷鍵連接的異麥芽糖分子，這個過程中產(chǎn)生的葡萄糖不是一種處于游離狀態(tài)的中間體，而是某種過渡態(tài)。

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Exploration into the enzymatic mechanism of α-transglucosidase

HUANG Jin-lian，HUANG Xiu-juan，ZHONG Zhen-sheng*
（School of Chemistry and Chemical Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Using High Performance Liquid Chromatography（HPLC)to track the transfer-glycoside process all the way.The enzymatic mechanism of α-glucosidase transferring maltose into isomaltose has been discussed. The results showed that in the transformation process，the α-glucosidase cut the α-1，4 glycosidic bonds into two glucose units firstly，then re-bonded by α-1，6 glycosidic linkage.And the isomerization process from maltose to isomaltose finished.The transglycosidation was happened intramolecularly.At the same time，the glucose units which dissociated from maltose reacted intermolecularly with maltose or isomaltose to generate panose or isomaltotriose.

α-transglucosidase;isomaltose;catalysis;mechanism;transglycosidation

TS201.2+5

A

1002-0306（2012)07-0108-04

2011－05－12 *通訊聯(lián)系人

黃金蓮（1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)。